QuEChERS法在兽药残留检测中的优化与应用

目前已有400多种兽药用于动物疫病治疗和预防以及提高饲料利用效率。而不合理甚至违法使用兽药，会导致动物源性食品及环境中兽药残留超标，致使消费者面临致敏、致癌、致畸、致突变以及肠道菌群被破坏等风险，从而威胁公共卫生安全。因此，如何快速、准确、灵敏地定量检测各种兽药残留，对保障公共卫生安全有着重要意义。目前免疫学检测方法（酶联免疫吸附实验试剂盒、胶体金试纸条等）已在兽药残留检测中得到应用。此类产品多用于现场快速检测和样品初筛，但稳定性差，定量分析能力不足，仅能同时检测一种或几种药物残留。色谱串联质谱或荧光检测器等仪器分析法具有灵敏度高、重复性好、定量检测能力强等优点，是欧盟推荐的有机残留物或污染物分析方法，也是兽药残留分析与确证的主要方法。

QuEChERS法简介

QuEChERS是一类样品前处理方法。因具有快速（quick）、简单（easy）、经济（cheap）、高效（effective）、可靠（rugged）和安全（safe）等优点，此类方法缩写为“QuEChERS”。2003年Anastassiades等首先建立了QuEChERS法，并用于检测水果和蔬菜等植物样品中的杀虫剂成分。QuEChERS法可大致分为两步：第一步，分离提取。在样品中先加入乙腈等提取液，再加入无水硫酸镁、氯化钠、硫酸钠等作为脱水盐，以分离有机相并促进待测物从水相转移到有机相，然后加入乙酸钠、柠檬酸钠等调节pH值，最后剧烈震荡、离心，取上清液。第二步，净化。在上清液中加入N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、十八烷基二氧化硅（C18）等吸附剂，同时常加入脱水盐，离心后取上清液，经简单处理即可上机检测。

与液液萃取、固相萃取等方法相比，QuEChERS法具有以下优点：一是效率高，操作方法简单，处理20个样品仅需40 min左右，极大提升了样品前处理速度。二是成本低，处理1个样品仅需约7元。三是绿色环保。所用试剂毒性较小，试剂用量较少；大部分操作在封闭的离心管中进行，不需要频繁开盖，对人员危害小。但该方法也存在净化效果较差、易受基质干扰等缺点，且检测复杂成分样品兽药残留的可用方法较少。

QuEChERS法优化

与植物样品相比，动物相关样品基质复杂，脂肪含量较高，因此需要对QuEChERS法进行优化，大多数根据目标分析物的物理化学性质，优化提取液、盐和吸附剂的量并尝试不同组合。此外，QuEChERS法还可以与其他提取净化方法连用，进一步提高提取效率和净化效果。通过不断优化，QuEChERS法可从不同基质中提取百余种兽药及残留。

提取液优化

QuEChERS法比较适合处理含水量较高的样品，如果要从蛋糕、奶粉等含水量低的样品中提取兽药，需要在样品中先加入水或其他水溶液。乙腈是QuEChERS法最常用的提取液，具有以下优点：一是乙腈对大多数兽药残留提取效果较好；二是与其他有机溶剂相比，通过盐析能较容易实现乙腈（有机相）与水相的分离；三是乙腈能够较好地使蛋白质凝聚变性从而沉降蛋白；四是用乙腈提取样品时，提取液基质效应较低。

与纯乙腈相比，在提取液中加入其他溶液能够实现更好的提取效果。最常添加的有机试剂是甲酸和乙酸，它们能使提取环境呈酸性，从而提高提取效率；在乙腈中添加甲醇等试剂，也能提高部分兽药的提取效果。乙腈使蛋白变性凝聚的效果较好，但同时可能会阻碍目标兽药的提取，因此加入乙腈前需在样品中添加水、Na2EDTA等溶液并混匀，或加入乙腈后通过物理方法混匀样品。此外，Na2EDTA溶液或缓冲液可有助于部分兽药的提取。2019年杨艳等使用含甲醇和甲酸的乙腈作为提取液（体积比，甲醇:乙腈:0.5%甲酸水溶液=2:5:3），建立了检测动物源性食品中11种喹诺酮类药物残留的方法。

使用缓冲液调节稳定pH值能实现优化试验的目的。常用的缓冲液包括，0.1 mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH约4.5）、500 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH约9.2）等。2019年Qie等使用Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液和乙腈，建立了能同时检测160余种兽药残留的方法。2018年Bessaire等使用磷酸盐缓冲液和乙腈，建立了从多样品中检测23种β-内酰胺类药物的方法。多种商品化QuEChERS试剂中含有缓冲盐成分，如许多试剂盒含1.0 g柠檬酸三钠和0.5 g柠檬酸二钠，溶解后pH约为5。

在提取多类兽药时，由于药物物化性质差异大，有时仅使用一种提取液难以实现对多类兽药的高效提取，因此有些试验使用不同提取液多次提取。2015年Wang等建立了检测牛奶中β-内酰胺类、大环内酯类、磺胺类等多种兽药残留的方法。该方法首先用1%乙酸乙腈提取样品，离心后在沉淀中加入1%氨水乙腈。2016年梁飞燕等建立了检测猪肉中磺胺类、β-受体激动剂、喹诺酮类、金刚烷胺和性激素等7类兽药残留的检测方法。该方法首先使用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取样品，然后离心取上清液，再向沉淀中加入2.5%乙酸乙腈。

脱水盐优化

QuEChERS法提取样品时，通常在提取时加入盐，以通过盐析作用降低兽药在水相中的溶解度，从而增大有机相中的兽药含量，促进水相和有机相的分离，并减少有机相中水的含量。常用的脱水盐包括，无水硫酸镁、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾等，其中最常用的是硫酸镁。另外，四环素类药物容易与钙、镁离子形成难溶的螫合物，因此在提取四环素类药物时常加入Na2EDTA溶液螫合金属离子，并避免使用硫酸镁。

吸附剂优化

常用吸附剂包括PSA、C18、GCB等。QuEChERS法提取样品时，多使用一种或几种吸附剂，并通过调整吸附剂的组分和质量，以增加对杂质的吸附并减少目标药物损失。PSA是一种极性吸附剂，对大多数基质净化效果较好，多用于去除极性糖类、脂肪酸、亲脂色素等极性基质。但PSA是一种碱性吸附剂，仅对酸性药物有吸附作用，因此使用时需添加一定的酸以减少兽药及残留的损失，且净化后的提取液有油脂残留。C18对非极性组分有很强的吸附作用，适合吸附从非极性到中等极性的脂类、糖类等亲脂型化合物，但过量的C18同时会吸附亲脂性较强药物。GCB通常用于去除色素，但同时也可较强吸附带苯环官能团的药物，如β-受体激动剂、甾体类激素等兽药。此外，弗洛里硅土、氨基（-NH2）吸附剂、氧化铝、锆基吸附剂（Z-Sep+）等多种吸附剂也在QuEChERS法兽药残留检测中得到应用。

高效吸附样品中的脂类是试验优化的重要步骤。但过量的C18、GCB等会吸附待检目标化合物，正己烷会溶解部分药物，冷冻除脂方法耗时较长，而新型脂类吸附剂则可在保留目标化合物的条件下有效除脂。2016年Han等验证安捷伦公司的Bond Elut EMR-Lipid试剂盒可高效除脂并可避免吸附待检药物。目前该试剂盒已经在QuEChERS法检测兽药残留中得到应用，并取得较好的效果。此外，新型的纳米材料吸附剂也得到了尝试应用。2019年López-García等建立了肉类中类固醇激素及代谢产物的QuEChERS检测方法。该方法使用纳米氧化铝和弗洛里硅土作为吸附剂，净化效果优于PSA。

其他

新型装置的开发与运用也有效提升了QuEChERS法的工作效率和提取效果。2017年Qin等建立了肉和牛奶中磺胺类、替米考星、阿维菌素等多种兽药残留的分析方法。该方法使用多次推送过滤净化装置（m-PFC），在十几秒内通过简单的多次抽拉注射器就可完成提取液的净化，省去了吸附剂与样品混匀及混合物离心取上清液等操作，从而提高了提取效率。

QuEChERS法应用

目前已建立了磺胺类、β-内酰胺类、大环内酯类、阿维菌素、喹诺酮类等违禁药物和常用兽药的QuEChERS提取方法，并在畜禽肌肉、内脏、鸡蛋、牛奶及相关产品以及尿液、粪便等环境样品兽药残留萃取中得到应用。目前QuEChERS法已在国内外兽药残留检测研究中得到较多关注（表1略），也是应用研究的重点。

在牛奶及奶制品多兽药残留检测方面，2012年张毅等建立了检测牛奶中硝基咪唑、“瘦肉精”、性激素、糖皮质激素、镇静剂、氯霉素等8类共40种禁用药物的液相色谱-质谱检测方法。将2 g样品酶解后，加入15 mL 1%氨水乙腈和5 g硫酸钠，涡旋离心，收集上清液；沉淀中加入15 mL 1%乙酸乙腈，涡旋离心合并上清液；将上清液减压蒸发至近干，复溶后检测。结果显示，所测药物的定量限为0.07~0.93 μg/kg，回收率为60.3%~119.3%。2014年Kang等建立了能同时检测奶粉中大环内酯类、磺胺类、喹诺酮类、四环素类、硝基咪唑类、“瘦肉精”和镇定剂等多类共100种兽药残留的检测方法。该方法先用5 mL Na2EDTA-McIlvaine缓冲液溶解1 g奶粉，再加入10 mL 5%乙酸乙腈、1 g氯化钠、4 g硫酸钠，振荡离心；取5 mL上清液加入200 mg C18吸附剂，振荡离心取上清液氮吹干；复溶后过滤膜检测。结果显示，92.9%的兽药回收率为70%~120%，定量限为0.1~25 mg/kg。

在鸡蛋、畜禽肌肉及内脏多兽药残留检测方面，2014年李娜等建立了能从鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝样品中检测磺胺类、喹诺酮类、四环素类和金刚烷胺等4类29种禁限用兽药的检测方法。该方法在样品中加入2 mL Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液、3 mL乙腈，涡旋离心收集上清液；沉淀中加入5 mL乙腈，涡旋离心后合并上清液；加入200 μL乙酸、1 g氯化钠，涡旋离心后取2 mL上清液；加入C18和NH2各100 mg，取上清液吹干；复溶后过滤膜检测。结果显示，29种兽药的平均回收率为71.5%~93.2%，检出限为0.3~3.0 μg/kg。2018年方从容等建立了鸡蛋中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、糖皮质醇类、雌激素类、氯霉素等11类共125种兽药残留的检测方法。该方法在样品中加入1 mL水、0.4 mL EDTA溶液、7 mL乙腈，振荡涡旋离心，取上清液加水定容至10 mL；冷冻去脂后，加入50 mg PSA、50 mg C18、250 mg硫酸钠，振荡后取上清液加水稀释，滤膜过滤后检测。结果显示，125种兽药的定量限为2~60 μg/kg，回收率为60.4%~119.3%。2018年Desmarchelier等建立了检测肌肉、鸡蛋等样品中阿维菌素类、林可胺类、大环内脂类、喹诺酮类等105种兽药残留的方法。提取时向样品中加入8 mL水、30 mL乙腈和30 μL甲酸，涡动混匀离心；取上清液加入4 g硫酸钠、1 g氯化钠、1 g柠檬酸三钠和0.5 g柠檬酸二钠，经1 200 mg硫酸镁、400 mg PSA、400 mg C18（待检药物为阿维菌素类共4种）或900 mg硫酸钠、50 mg PSA、150 mg C18（待检药物为非阿维菌素类药物）净化，取上清液氮吹干，复溶后检测。结果显示，检测限为13~52 μg/kg。

在其他样品的多兽药残留检测方面，2019年Qie等建立了能检测畜禽血液或尿液中镇静剂类、大环内酯类、喹诺酮类药物、磺胺类、糖皮质激素类、β-受体激动剂等17类160种兽药残留的方法。样品中加入3 mL EDTA-McIIvaine缓冲液、10 mL乙腈和商品化试剂（4 g硫酸钠、1 g氯化钠），涡旋振荡离心；取8 mL上清液浓缩至2 mL，加入到活化好的安捷伦d-SPE EMR-Lipid试剂盒中，涡旋震荡离心，取上清液过滤后检测。结果显示，药物检测限为1~5 ng/mL，平均回收率为60%~120%。

展望

QuEChERS法具有效率高、经济、简便、环保等优点，目前已在畜禽产品兽药残留检测中得到应用，且新的方法持续出现，成本不断降低，提取速率进一步提高。Pouliopoulos等建立了从人的血清或血液中提取分析多种精神类药物的方法。该方法用试剂量少，萃取剂为600 μL乙腈、5 mg 碳酸钾和150 mg硫酸镁，提取效果良好，不需要吸附剂除去杂质便可检测。沃特世公司的PRiME HLB和安捷伦公司的EMR-Lipid等固相萃取柱产品，吸附提取液中的杂质时，经净化的提取液和目标化合物可从萃取柱中“漏出”，从而实现了高效净化，并且得到广泛研究与应用。自动化提取装置与仪器也不断推出，不仅节省了工作人员负担，也提高了工作效率。相信在将来QuEChERS法会得到持续优化与发展，并将在动物产品残留检测中发挥重要作用。