实操技巧︱光纤记录实验流程及注意事项

光纤记录（Fiber photometry）通过记录特定脑区群体神经元的荧光强度变化来表征神经元的群体活性变化，常用于钙信号记录以及神经递质信号检测。在神经环路研究中，光纤记录系统可以对自由活动动物的群体神经元进行长时间稳定监测，进而探究神经元活动与动物行为的相关性。

一、常见光纤记录实验流程

1、脑立体定位病毒注射

2、陶瓷插针植入

3、荧光信号记录

4、动物行为检测

5、组织切片染色

二、光纤记录实验常见注意事项

脑立体定位手术注意事项

(*影响实验成败的关键步骤）

1、利用光纤记录系统可记录深部脑区荧光信号的优势，选取拉制好的玻璃微电极组合制作的注射器给动物脑内注射荧光病毒，可有效减少脑深部损伤和出血。玻璃微电极注射器制作方法：

2、完成病毒注射之后直接植入陶瓷插针，在较短时间内的重复定位操作产生的坐标误差更小，并且让实验效率更高。

3、为提高实验成功率，实验过程中陶瓷插针植入的位置请尽量保持在病毒注射坐标的100微米以内。可以从下图中看到，当距离超过100微米时，信号的强度明显下降。

（▲图片来自文献Han Qin et al., Neurophoton, 2019）

光纤记录实验中选择耗材配件注意事项

1、耗材材质

由于光纤记录实验对环境光非常敏感，建议在实验过程中选择光线稳定、较暗的实验室；在耗材选择上选用黑色陶瓷插芯和黑色陶瓷套管，可以很好地避免环境光对实验动物脑内荧光变化的干扰。

2、耗材参数

光纤耗材的数值孔径与照射角度和激光辐照范围相关。光纤记录实验建议选择更大NA数值，以更好地覆盖大脑目标区域的荧光细胞。实验过程中所有耗材配件选择相同的芯径，NA数值可以达到最佳的实验效果。

光纤记录实验前需进行光漂白

光漂白是指将光纤暴露在高强度的激光下，使光纤内的荧光物质失活(或“漂白”)。由于任何材质的光纤都具有一定的自发荧光，自发荧光会影响或者掩盖真实的荧光信号，同时荧光物质被漂白后会逐步恢复，因此光漂白必须在任何光纤记录实验之前进行。一般选择激光器对光纤进行照射1.5h-2h则可以减少70%以上的自发荧光。

光纤记录实验中同时记录410nm信号的必要性

在光纤记录实验中，会出现人为引入的噪声(Artifacts)影响，包括组织损伤引起的自发荧光(Autofluorescence)，动物自由活动引发的运动噪声(Motion-Induced Changes)，长时间记录诱发的光漂白 (Photobleaching)，以及其他非钙浓度变化引起的假阳性信号干扰。

410nm激光不会对荧光蛋白的信号产生影响，但是可以反应上述干扰因素的信号变化从而用于反映背景噪声信号。如视频所示，数据处理过程中，通过运动矫正（Motion Correction）可以去除背景噪音信号直接得到真实的荧光数据。

荧光数据与动物行为数据同步分析

光纤记录实验数据往往记录动物特定的行为下或者特定实验处理因素下的荧光数据变化，那么信号记录过程中事件标记就显得格外重要。

以瑞沃德光纤记录系统软件功能为例，在荧光数据记录时即可选择同步记录动物的行为视频，也可设置不同的打标方式，如ROI区域打标、手动打标等。数据分析时，软件支持荧光数据与行为学视频同步导入分析，事件标记会直接呈现在信号窗口，同时也支持分析过程中手动添加事件标记。

（▲瑞沃德光纤记录系统软件界面）

三、瑞沃德双色多通道光纤记录系统

产品特点

1、软件集成数据采集，分析作图，行为学采集，分析作图模块

2、10种自定义打标方式，软件可对实验过程中特殊行为事件或外部输入信号进行同步标记，行为学模块可同步设置事件标记

3、高灵敏CMOS相机，高帧速300FPS、高量子转化效率≥80%、低噪声、高增益

4、配置荧光漂白器，减少耗材自发荧光干扰

5、4 input和4 output接口，方便与外部行为学、光遗传、电生理等设备进行同步实验，满足刺激、记录的闭环研究

（▲瑞沃德双色多通道光纤记录系统）

西安交通大学客户使用现场

（▲瑞沃德双色多通道光纤记录系统）