细胞培养如何应对支原体污染

一．支原体的介绍

支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞微生物，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。革兰染色为阴性，但不易着色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。支原体在自然界分布广泛，无细胞壁，直径为0.1-0.3μm，且形态易变，极易通过除菌过滤器。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，适合于偏碱条件下生存（pH7.6—8.0），对酸耐受性差，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体，其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。

（1）细胞之间交叉污染；

（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等；

（3）工作环境或实验器材的污染；

（4）培养基的污染。

三．支原体污染的严重性

（1）细胞外形可以没有明显的变化，支原体可以与细胞共存，污染后细胞液不会死亡，培养基一般不发生浑浊；

（2）使用被支原体污染的细胞做实验会严重影响实验的结果，因为支原体会抑制细胞生长；导致染色体畸变；细胞膜抗原性改变；细胞复苏后存活率降低等。

（3）影响细胞的代谢和功能：培液中的精氨酸被支原体大量消耗，引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍；支原体活动使培液成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢。

（4）培养过程中细胞破碎较多，培养基pH变化明显，需要频繁更换新鲜培养基；

（5）细胞被支原体污染后会形成共生体系导致污染不断扩大。

四．支原体的检测方法

支原体的污染需要特殊的检查方法，常用的有 DNA 荧光染色法、支原体培养、ELISA、电镜和聚合酶链式反应（PCR）等，由于支原体种类众多，检测有失败的风险，通常推荐采用两种以上的检测方法。

2015版中国药典规定：“主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检査支原体，必要时，亦可采用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。”

（1）DNA染色法：用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。

Vero细胞DAPI染色荧光照片(400×)。A，感染支原体的Vero细胞。蓝色卵圆形荧光物质为Vero细胞核，其周围蓝色荧光小点为支原体(箭头)；B，未感染支原体的阴性对照Vero细胞；C，加入待检培养液的Vero细胞(未感染支原体)。

（2）低涨处理地衣红染色观察法：用2 %醋酸地依红染色固定后，封片，镜下观察支原体呈暗紫色小体，附于细胞外或散在于细胞之间。

（3）培养法：将细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

（4）ELISA：有专为支原体检测开发的酶联免疫分析试剂盒，通过样品显色反应与标准品对比得出结果。

（5）电镜：一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。

支原体电镜扫描图片

（6）PCR：PCR检测法灵敏度高，特异性强，只用一天时间即可快速检测细胞培养液中的支原体，是一种检测支原体的有效手段。引物来自支原体的保守16S-23S的rRNA序列，由于这段spacer的序列随支原体种类不同而不同，因此可依所复制的DNA大小及其特异性片段的大小来作检测及鉴定，目前也有专门的试剂盒，如PCR Mycoplasma Test Kit（Applichem）。

PCR法支原体检测电泳图。+：阳性对照；-：阴性对照；1：送检样品1（感染支原体）；2：送检样品2（未感染支原体）；3：样品1的干扰实验；4：样品2的干扰实验。若在270bp处有条带，检测结果为阳性。阳性对照及干扰实验PCR产物在270bp处有一条带，阴性对照无条带，证明本次实验准确可靠。

五．避免支原体污染的方法

细胞培养中要从多方面避免支原体的污染：

（1）控制环境污染：可以使用支原体清除喷雾（Mycoplasma-Off）进行空间消毒；用新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室或用甲醛熏蒸法消毒无菌室；生物安全柜或超净工作台也要定期消毒；每次使用生物安全柜或超净工作台后要做好清洁工作，减少不必要的物品堆放在内部；在水浴锅中加入消毒试剂，如Aquabator-Clean（Applichem）；在培养箱的水源中加入消毒试剂，如Incuwater-Clean（Applichem）。

（2）严格操作要求：工作开始要先用75%酒精消毒手部以及袖口、瓶口等；在进行多种细胞培养操作时，所用器具（如移液枪等）要严格区分；在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细菌带到培养液中污染其他细胞。细胞培养实验室应制定严格的管理制度，按照规范的实验程序操作。

（3）保证细胞培养基和器材无菌，器材一般都经过辐射处理，基本可以保证无菌，商业化CD培养基一般也能保证无菌。如实验室有发现支原体感染，已经开启的培养基不宜继续使用。

（4）在培养基中加入适量抗生素：对支原体比较有效的抗生素为四环素类和大环内酯类，如卡那霉素50μg/ml，一些氟喹诺酮也有抑制支原体生长的作用。也有专用的支原体清除剂可用来预防细胞被支原体污染，如在培养基中添加Plasmocin? prophylactic，工作浓度5μg/ml。

六．细胞被支原体污染后的清除策略

（2）用MRA处理：用支原体清除剂（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，如Plasmocin? treatment，作用浓度为 25μg/ml，两周可以清除支原体。

（3）用清洗纯化法清除支原体污染的方法：细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤，其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

（4）药物辅助加温处理：先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

（5）使用支原体特异性血清：用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

（6）动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

（7）巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止。

（8）使用支原体清除培养基，每2~3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞1~2次；期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要用胰酶消化），并更换新的培养器皿，3天之后，即可见明显清除效果；处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全；如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天；为避免细胞再次受到“支原体”的污染，以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

总结

参考文献：

1.张元兴、易小萍、张立等，动物细胞培养工程[M]，化学工业出版社，2007年1月。

2.国家药典委员会，中华人民共和国药典[M]，中国医药科技出版社，2015年6月。

3.吕沅冈、俞峰、朱德厚等，细胞培养中支原体的去除[J],中华微生物学和免疫学杂质,1995年12月。

4.张春彦、李伟英。细胞培养中支原体污染的常规防治[J]，结核病与胸部肿瘤，2009年第二期。