凝胶渗透色谱柱的柱效评价

液相色谱技术的高速发展带动了凝胶渗透色谱柱制造技术的发展，也促进了凝胶填料和填装技术的发展，每根凝胶渗透色谱柱出厂时都标明了柱效，但每个厂家测定柱效的方法却大相径庭。凝胶渗透色谱柱是整个GPC分离系统的心脏，所以对色谱柱柱效能的评价非常重要。

和气相色谱一样，液相色谱试样中的各组分的谱带在通过色谱柱后都要变宽，各谱带要实现完全的分离，只有当它们的加宽不比它们的分离快时才能实现，谱带的加宽实质上反映了色谱柱的分离效率：或者说柱效就是一根色谱柱提供窄谱带(小的W值)的能力。对于GPC的柱效评价问题，由于它的特殊性和复杂性，有必要在这里进行较为详细的讨论。

色谱柱的效率可以很好地表明色谱体系能使色谱峰扩张到什么程度。对于单分散的试样来说，在理想的情况下，GPC色谱图应该如图3-12a所示，即应为一条直线。但在通常的条件下，所得到的GPC谱图却是图3-12b的情况。这就是如前所述的GPC的峰加宽反应，于峰加宽效应越大的柱子，则所得到的色谱峰形状就越宽，而测得的柱效也就越低。

因此，用一般评价色谱柱效率的方法，用于评价凝胶渗透色谱柱是否适用，看来是个值得商榷的问题。理论塔板数和相应的板高是色谱的一个重要的动力学参数，把它用来描述色谱柱的分离效率，还是Giddings等首先提出来的。理论塔板数概念起源于Martin和Synge的理论塔板模型，它是从精馏理论借用过来的，每一个理论塔板就意味若达到气相与液相间的一次平衡。在GPC分离中，指凝胶空隙中的溶剂与凝胶孔内溶剂之间的一次平衡。

由于这两相总是处于不断的运动之中，这种平衡事实上很难真正达到，因此理论塔板数就失去了它真实的含义。另一方面，对于不同的溶质，即使在相同的色谱条件下，计算得到的理论塔板数也随容量因子的不同而变化。因而一根色谱柱的柱效让使用者感觉变化无常，即使用相同的条件测定，其值也与文献 道的很难一致。特别是凝胶渗透色谱柱，由于峰加宽效应比其它色谱方法更为突出，这是由于GPC所研究的对象主要是高聚物分子，一方面它的淋洗体积Ve有明显的分子量依赖性（大分子先流出，小分子后流出），另一方面峰宽W不仅与色谱体系（如峰加宽效应）有关，而且还和试样的分子量分布有关，因此(3-16) 式所表示的理论塔板数N有分子量和分子量分布的依赖性，也有峰加宽效应的依赖性。

为此，Bly曾建议用已知分子量分布的高聚物样品来测定凝胶渗透色谱柱的柱效。BidJingmeyer等在总结前人工作的基础上，集中讨论了柱效的各种测量和计算方法，并对影响柱效测定的各种因素进行了讨论。指出淋洗液的组成和粘度以及线速度的大小，测量塔板数时所使用的溶质的性质、温度、柱长、填料类型、颗粒尺寸以及计算塔板数时选择的方法等都会影响柱效的测定。

众所周知，以往测定GPC的理论塔板数多用已知分子量的单分散纯物质(如甲苯、苯、邻二氯苯、对二氯苯、1,2,4-三氯苯、乙腈、苯甲醇等)，用所得到的色谱峰求出峰顶位置的最大淋洗体积Ve，以及峰两侧曲线拐点处作切线与基线所截的宽度W，然后按(3-16)式计算N值。现在看来，这种测量计算柱效的方法套用在GPC柱效的测定中是不恰当的。因为GPC中存在着凝胶粒间体积Vo，因此N不能完全反映柱效，特别对于那些较早淋出凝胶渗透色谱柱的组分，应在扣除Vo后求出的有效塔板数N有效才能真实反映GPC的柱效率:

表3-16是两种不同溶质测定GPC理论塔板数的比较。对于相同规格，但凝胶平均孔径不同的μ-Styragel系列柱，应用甲苯测得的N值比已知分子量分布的聚苯乙烯测得的N值大。由此可见，高聚物的多分散性(即分子量分布)导致GPC谱峰变宽，W增大，故柱效降低。Knox等应用多分散的高聚物试样测定GPC的柱效时，提出应进行必要的修正。并证明对多分散样品Bly曾建议的柱效方程(3-21) 和(3-22) 式是不适用的。若用H表示塔板高度，则

式中Napp、Happ分别为从实验得到的GPC洗脱峰按(3-16)式及(3-19) 式计算的近似塔板数和板高，D为分布宽度指数(

),高聚物的多分散性会导致GPC峰宽增加，造成H增大，N值减小；而(3-21)式和(3-22)式低估了高聚物多分散性对GPC柱效的影响。事实上多分散性对GPC的柱效的影响是很大的。现在我们就以D=1.01和D=1.09的高聚物样品为例来证明多分散性对柱效的影响。由于高聚物的重均分子量

和数均分子量

。可分别表示为，

这里f(M )dM是分子量范围从M- M + dM的高聚物组分。图3-13表示分布宽度为D=1.09的高聚物的GPC分布曲线。若用峰分布方差表示，则

f(M)和

的值与

和

有关，可用方程(3-26)表示:

由方程(3-24) 和图3-13表明，对于分散度较低(D=1.09) 的高聚物样品，σM实质上是

的分数。图3-14表示高斯形分子量分布曲线(D=1.01)， 说明是个接近单分散的高聚

物。为了定量测定CPC的平均分子量和分子量分布，必须依赖表征分子量M与淋洗体积V0之间关系的校正曲线，如图3-15所示。图中V0为凝胶填料间的空隙体积，Vi是凝胶孔体积，Mu和ML是对应于V0和Vi的高分子排斥和低分子全渗透的分子量的极限值，可通过GPC实验和校正曲线外推而得，M*为对应于淋洗体积

的校正线线性部分的中值分子量。

的校正线线性部分的中值分子量。

由于GPC填料对分子量的选择性可方便地用S表示，S是校正线线性部分倾斜度的倒数:

1/S = -dInM/dV (3-27)

因为Vi= V0+ Sln(Mu/ML) (3-28)

对于任一中间分子量M，总是靠近M*，则

V M=V*+SIn(M */M) (3-29)

若M=M*+δM，则

方程(3-30)可用于高聚物样品，此时

= M*，淋洗体积将被定位于中心V*，第2个峰参数的体积将用

表示:

对于一个窄分子量分布的高聚物，我们可以假定f(M)的谱图为高斯分布图，则

这里σM是分子量分布的标准偏差，由于D=1.01， 所以σM/`Mn=0.1， 由此可见，分布宽度很窄的高聚物样品对σM的影响也是十分显著的。如果将方程(3-32) 的f(M) 代入方程(3-31)，并依次展开对数因子和一系列积分，则可导出:

式中a为校正因子，可由下式给出:

a是D的函数，两者的依赖关系可表示在图3-16中。由于这个单独的方差是附加的，因此我们可以将总的峰方差描述为:

而

对于

和方程(3-33)， 可得到:

则近似的塔板数Napp和板高 Happ可表示为:

这样，我们可以得到:

式中(S/Ve) 是假定的分子量测定范围，由以e为底的乘方和淋洗体积Ve来确定。这个比值若以X代替，则X=(Ve/S)。X的值通常在4~12范围内，在GPC的凝胶孔大小尺寸一致时才能成立。经整理可以得到:

由此可见，对于方程(3-43)， 当用单分散的聚合物测定柱效时，则N=N app；而对于多分散样品它是从具有无限大的柱效Napp的柱子淋洗出来，则最大Napp值可表示为:

Napp(最大)的计算值如表3-17所示。表3-17中 D和X具有不同的值，多分散度在中等柱效

(N=1000)时，对最大柱效Napp(最大)的影响在表列台阶线以上无明显影响，但随分散度的增大，在表列台阶线以下对柱效有显著的影响。

表3-18说明多分散度与动力学参数N值对Napp的联合影响(X=8)。对于表列值高于台阶线以上的值，当假定N=Napp时，其误差低于15%；对于低柱效(N=300)， 其Napp值相差甚小，几乎是均等的，此时高聚物的分散度不能大于1.03；如果N=1000，则多分散度必须低于1.01。显然，GPC的真实塔板数或板高不能通过单分散的聚合物标样来测定，因为多分散高聚物试样的分散度很少低于1.03的。因此，由表3- 19和图3-16的值可以明显看出，Bly给出的方程(3-21) 式和(3-22) 式所计算的柱效经常偏低很多。现将应用公式(3-21)和(3-43) 计算的NV值的比较列于表3-21之中。可见仅在N值十分接近Napp值时，

Bly的柱效方程给出的值才是准确的。除此而外，用多分散的高聚物来测定GPC柱的柱效其结果总会引入很大的误差。表3-19的结果还表明，D值必须低于1.03时，计算的N值才是可靠的。

综上所述，应用多分散的聚合物试样来测定GPC柱的真实塔板数或板高时必须要进行修正。因为当一个多分散的高聚物溶液注入凝胶渗透色谱柱中时，则多分散度D引起的谱峰展宽和动力学过程将在柱内出现，导致GPC柱效发生相应的变化，此时Bly所定义的GPC柱效方程将是不适用的。Knox用实验证明，应用(3-42) 或(3-48) 式计算柱效却能反映GPC对多分散样品的真实分离效率。从而提出真实的塔板数或板高不能从高聚物单分散标样的淋洗峰取得，因为它们的分散度远大于1.01。

由此可见，如果采用已知分子量分布的单分散高聚物来测定GPC的柱效，可以证明在校正曲线logM-Ve的直线部分W/D是个常量，为了消除多分散性(即一般单分散高聚物标样的D值多在1.01~1.10之间)对柱效的影响，拟可用下式计算理论塔板数:

实际上(3-45) 式与(3-21) 式是等同的，它们都适用于分布宽度小于1.03的高聚物标样。

对于用多分散高聚物(D> 1.03以上)来测定GPC的柱效时，就必须按照Kuox提出的柱效修正方程(3-42) 式或(3-43) 式来评价柱效率。