论文｜过表达KAR2基因对毕赤酵母产米黑根毛霉脂肪酶的影响

单位：江苏师范大学药用植物生物技术实验室，生命科学学院

基金项目：国家自然基金青年基金项目（31901629）。

OSID开放科学计划

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为异源基因的表达体系已有近30年的历史，目前已发展成生产异源蛋白质最重要的工业宿主之一。2009年，巴斯德毕赤酵母完整的基因组序列被公布。据统计，有超过5000种异源蛋白在巴斯德毕赤酵母表达体系中成功表达。

异源蛋白的产量受诸多因素影响。提高异源蛋白产量的研究主要集中在优化培养条件、启动子类型、外源基因密码子、外源基因拷贝数以及蛋白折叠过程和分泌途径的改造。特别是在多拷贝重组菌株中共表达蛋白合成分泌途径中的伴侣蛋白，以缓解因异源蛋白过表达引起的宿主蛋白折叠压力和分泌阻力，从而达到增加异源蛋白产量的目的。其中与内质 中未折叠蛋白反应 (UPR) 相关的HAC1、KAR2、PDI和ERO1等基因的共表达可分别增加内聚葡萄糖1、生物表面活性剂HFPI、人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的抗体片段（2F5mAb）和α-半乳糖苷酶的产量。但不是共表达伴侣蛋白都可以提高蛋白产量，研究发现，过表达PDI降低了猪胰岛素前体在毕赤酵母中的表达水平。

在4个UPR相关基因中，Kar2p可与新生肽结合，促进其进入内质 。米黑根毛霉脂肪酶(RML) 是一种重要的工业用酶，因其能够催化水解、酯化、转酯化和氨解等多种反应，广泛用于饲料、油脂加工、食品风味改良、医药和能源等行业中。研究前期，获得了一株胞外产RML的4-拷贝毕赤酵母重组菌株（4pRML-X33）。目前尚没有KAR2基因在多拷贝rml毕赤酵母重组菌中过表达对RML产量影响及机制的研究。

目 的

通过在4-拷贝的RML生产菌株（4pRML-X33）中过表达KAR2基因，探讨其对RML胞外酶活的影响及机制，为研究异源蛋白在毕赤酵母中表达提供新的参考依据。

方 法

通过PCR方法从毕赤酵母菌株中克隆到KAR2基因，并用毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K构建过表达质粒KAR2-pPIC3.5K。用电转化的方法，将KAR2-pPIC3.5K二次转化到含4-拷贝rml基因的毕赤酵母重组菌株4pRML-X33中，获得能同时过表达RML和KAR2p的二次转化子4pRML-X33-KAR2，进行摇瓶发酵和RML酶活检测。采用RT-qPCR方法分析菌中rml及UPR相关基因的转录水平（相关引物见表1）。

结 果

◆过表达质粒KAR2-pPIC3.5K的构建

根据pPIC3.5K多克隆位点和KAR2基因的特点，在KAR2基因的上游和下游引物上分别引入BamH I和NotI酶切位点。以X-33的gDNA为模板，通过PCR扩增获得KAR2基因，基因长度为2037bp (图1 A)。用质粒提取试剂盒提取pPIC3.5K载体，载体大小为9004bp (图1B)。用BamH I和NotI双酶切KAR2基因片段和pPIC3.5K载体 (图1C)，并通过T₄DNA连接酶将二者连接，转化到大肠杆菌中，提取转化子中的重组质粒。用BamH I和NotI双酶切筛选重组质粒，发现出现2条带:一条大小约为2037bp，另一条约为9004bp (图1D)。将KAR2-pPIC3.5K送至苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测定，发现测序结果与GenBank: NC_012964.1中序列完全一致，获得KAR2-pPIC3.5K重组质粒。

注：A.PCR扩增获得KAR2基因；B.电泳检测提取的pPIC3.5K载体；C.BamH I和NotI双酶切KAR2基因片段和pPIC3.5K载体；D.BamH I和NotI双酶切筛选正确的KAR2-pPIC3.5K质粒

图1 KAR2-pPIC3.5K胞内表达质粒的构建

◆过表达菌株4pRML-X33-KAR2的构建及验证

按照前述方法，用BspE I线性化重组质粒KAR2-pPIC3.5K后，采用电转化的方法将线性化的质粒二次转化到4pRML-X33中。G418和Zeocin双抗性平板筛选得到4pRML-X33-KAR2转化子 (图2A)。将转化子进行平板划线扩大培养，取3个转化子用D-2 buffer提取转化子的gDNA。分别以3个转化子的gDNA为模板，5’AOX1和KAR2-R引物进行菌落PCR验证阳性转化子，结果见图2B。结果发现，3个转化子均扩增到目的条带，说明均为阳性转化子，成功筛选到4pRML-X33-KAR2菌株。对照菌株4pRML-X33-3.5K是将pPIC3.5K线性化后电转到4pRML-X33。

注：A.G418和Zeocin双抗性YPDS平板筛选KAR2过表达菌株；B.PCR筛选KAR2过表达菌株；M.DNA Marker；1~3.以KAR2基因转化子gDNA为模板；4.以4pRML-X33 gDNA为模板的负对照

图2 KAR2基因过表达菌株4pRML-X33-KAR2的筛选

◆过表达KAR2基因对4pRML-X33菌株产酶的影响

将菌株4pRML-X33、4pRML-X33-3.5K和4pRML-X33-KAR2进行摇瓶发酵，每隔24h取样测细胞密度(OD₆₀₀)及胞外酶活（图3）。从图3A发现，4pRML-X33-3.5K和4pRML-X33-KAR2的细胞生长与4pRML-X33一致，说明pPIC3.5K和KAR2基因对重组菌株生长无影响。各菌株胞外酶活曲线见图3B，从图中发现3株菌的胞外酶活均在96h时达到最大。4pRML-X33-3.5K与4pRML-X33胞外酶活曲线基本一致，说明pPIC3.5K对菌株胞外酶活无影响。但4pRML-X33-KAR2的胞外酶活比4pRML-X33和 4pRML-X33-3.5K都低。发酵96h时，酶活从303.03U/mL (4pRML-X33-3.5K)下降到151.52U/mL (4pRML-X33-KAR2)，降低50%。说明过表达KAR2基因显著降低了菌株的胞外酶活。该结果与过表达KAR2基因降低假黑盘菌素在毕赤酵母中表达量一致。另外，通过SDS-PAGE检测了4pRML-X33-KAR2的胞外目的蛋白，结果见图3C，发现在45~60kDa有目的条带。RML的蛋白大小预测值为43kDa，但由于毕赤酵母对RML进行糖基化修饰，导致其分子量变大。

注：A.菌体生长曲线；B.胞外酶活曲线；C.SDS-PAGE检测过表达菌株胞外目的脂肪酶

图3 重组菌株摇瓶发酵及蛋白检测

◆荧光定量PCR分析

在蛋白过量表达时，大量新生肽进入内质 ，会引起内质 中蛋白折叠压力，大量错误折叠或未折叠的蛋白聚集在内质 腔中，打破内质 腔的稳态。为维持内质 腔的稳态，细胞会激活一系列信号途径帮助恢复内质 的内环境，包括加强内质 中蛋白折叠的能力和加速错误蛋白或未折叠蛋白降解等，该过程称为解折叠蛋白反应，即UPR。4pRML-X33-KAR2菌株的胞外RML酶活降低，推测是KAR2基因过表达，使大量新生肽进入到内质 中，导致蛋白折叠压力增大，引起UPR反应。HAC1、KAR2、PDI和ERO1的转录水平变化可指示细胞内是否发生UPR反应，进而表明是否产生内质 中蛋白折叠压力。

该研究采用RT-qPCR法比较4pRML-X33-3.5K和4pRML-X33-KAR2菌株中与UPR相关的基因转录水平变化，同时检测了目的基因rml的mRNA量变化，结果见图4。从图4可以看出，与4pRML-X33-3.5K相比，4pRML-X33-KAR2中KAR2基因相对转录水平提高了3.7倍。另外，还发现HAC1的相对转录水平显著降低，但PDI和ERO1的相对转录水平未发生显著变化，即KAR2基因过表达并未造成内质 中蛋白折叠压力的增大。

有趣的是，从图4中发现4pRML-X33-KAR2中rml的mRNA量显著降低了43%，说明KAR2基因过表达导致了rml的mRNA量显著减少。平rml的mRNA减少量（43%) 与胞外酶活减少量 (50%) 基本一致，认为4pRML-X33-KAR2胞外酶活的降低是rml基因的mRNA量下降导致的，而不是加剧了内质 腔的蛋白折叠压力。

注：用SPSS统计软件计算数据的偏度和峰度值。对于正态分布数据，采用不配对、双尾、方差不等的t检验来评价其显著性，用“*”或“**”表示,分别代表P≤0.05或P≤0.01,P≤0.05为差异显著，P≤0.01为差异极显著

图4 RT-qPCR检测rml和UPR相关基因的转录水平

结 论

该试验通过在产RML的多拷贝菌株4pRML-X33中过表达KAR2基因，发现过表达KAR2基因对菌株生长无影响，但胞外酶活从303.03U/mL下降到151.52U/mL，下降50%。

通过RT-qPCR分析UPR相关基因的转录水平变化，发现过表达KAR2后，仅HAC1的相对转录水平下调，PDI和ERO1基因转录水平未显著变化，说明未增加内质 中蛋白折叠的压力。

另外发现，KAR2过表达后使菌株中rml的mRNA量下调43%，与酶活降低量基本一致，说明KAR2过表达导致RML胞外酶活降低是因为减少了菌株细胞内rml的mRNA水平。

研究探讨过表达KAR2使RML胞外酶活降低的原因，可为过表达伴侣蛋白影响其他外源蛋白的表达提供参考。

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?采编：小白 ?排版：小同