过柱纯化手段通常作为上样分析前样品预处理的最后一步，和其他样品提取技术结合使用。针对极其复杂样品基质时，通过单一手段提取后的样品可能仍然因组成过于复杂或是物理性状不适合而无法直接上样分析。将样品过柱，利用色谱填料的选择性进行进一步提纯和溶剂转化，是一种有效但通量较低的预处理手段。早期最常用于预处理的色谱柱为酸性硅胶床、多段硅胶柱、氧化铝柱或弗罗里土柱（florisil柱）。酸性硅胶柱主要用来除去样品中的类脂和非持久性污染物。氧化铝柱和弗罗里土柱用以除去非极性干扰物。多段硅胶柱则指在同一柱管中依次填装酸性、中性和碱性硅胶成柱，以增加样品净化能力。这些色谱柱多在实验室用玻璃柱管自行填充，需经脱活、填充、淋洗、上样洗脱、洗脱液浓缩、定容等多个步骤，耗时长，溶剂消耗量大，需要有经验的实验人员手动操作，偶然误差较大，重现性不够好；但另一方面，该技术手段发展已经比较成熟，而且搭建成本很低，针对特定样品仍不失为一种有效的预处理技术。除此之外，现代色谱技术除作定性、定量分析外，也可以用于样品预处理，和传统柱色谱技术相比，除仪器化程度高、可靠性强外，其强大的分离性能和多样的分离机理也是显著的优点。本节重点介绍几种选择性较强的基于现代色谱技术的选净化手段。
一、凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，GPC）也称体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography SEC），是根据样品中不同组分的尺寸不同对其进行分离的一种预处理技术。
更多的仪器学习资料，在仪器学习
?
类似常规液相色谱柱，将具有一定尺寸孔隙的填料填充在柱管中，先用流动相平衡色谱米使填料孔隙中充满流动相；然后样品被引入柱管，分子尺寸较小的组分可以进入固定相中，探留时间较长；而无法进入孔洞的大分子则很快被流动相冲出柱管，保留时间较不同组分的分子尺寸大小和保留时间呈反比关系，由此可以分离和收集样品基质中不同尺寸范围内的感兴趣组分。因为其分离机理完全依赖于样品中各组分的尺寸大小，这种分离方法只能作为一种粗分或预分离的手段，如果需要对样品中某类物质进行更加准确的定性或量测定，必须对经过GPC分离和采集的馏分进行进一步分析。
这一方法最成功的应用范例是测定聚合物的分子量分布，但也可以用在复杂基质样品，如食品或天然产物中蛋白质、脂类和小分子物质的分离。传统使用的填料是多孔凝胶，不破生物活性，能耐各种极性的有机或水相流动相，但不耐高压。如采用能耐高压的交联聚苯螺二乙烯基苯微球或球形硅胶，可望获得更高的分离度，但需要注意选择适当流动相，以免无谓降低柱效和柱寿命。在上柱前，需要去除在凝胶色谱流动相中溶解度相对较差的物，以免造成净化过程中固体组分析出堵塞色谱柱。还应注意，在分析基质复杂的实际样品时，应在净化前先行去除油脂成分，因为凝胶色谱柱对油脂的承受能力有限。
除填料种类外，更重要的是根据分离目标分（和预排除杂质）的尺寸范围，选取最适合的填料孔径和分离范围。市面上已有种类繁多商品化 GPCSEC色谱柱可供选择。分离范围广的色谱柱通用性可能较强，但分离度相对较低。应尽可能选择和样品组分分子量围相近的色谱柱以达到最佳分离效果。
GPC/SEC法使用的仪器和常规液相色谱法非常类似，也由溶剂泵、进样器、柱温箱和检测器组成。但此法通常只需要一种流动相完成色谱分离，比常规液相色谱构成简单。虽然此法需要专门的色谱柱和仪器，成本较高，但自动化程度较高，方法重现性好，偶然误差小，尤其是选择性高于其他样品预处理方法，如需测定组成复杂的样品基质中微量和痕量组分，如食品中的农药残留或卷烟烟气中的致癌物等，GPC/SEC仍是一种值得信赖的预处理手段。
二、免疫亲和色谱
免疫亲和色谱（Immuno affinity Chromatography， IAC）是以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为原理的色谱技术，针对特定目标抗原，制备相应抗体，用溶胶凝胶法或其他方法，将抗体与惰性基质（如硅胶或凝胶）偶联成固定相填料后装柱。这样的色谱填料具有相当高的特异性，特别适合富集分离复杂基质样品中痕量大分子物质。当含有目标组分的样品通过IAC柱时，固定抗体选择性地只结合待测物，其他不被识别的杂质都被洗脱流出IAC柱之后再将抗原抗体复合物解离，待测物即可被洗脱进行下步处理或直接上样分析。
IAC方法的发展和操作一般包括
（1）针对目标组分确定适当的抗体。如有必要需要在实验室自行制备抗体使用。抗体和惰性基反应后装柱备用，可以是传的玻璃色谐柱，也可以是类似市售SPE小柱的针筒状小柱。
（2）样品上柱前，需要对IAC净化柱进行平衡。常周酸盐缓冲液（PBS）进行淋洗。
（3）样品均质化后上柱，保留富集标组分，洗脱其他杂质。通过采用水相洗脱实现，多加缓冲盐调节pH值保证抗体蛋白的活性和免疫亲和反应条件。保持适当的离子强度还有助于减少固定相的非特异性吸附。
（4）洗脱目标组分。此步洗脱液中通常会加入适当比例的有机相，但为免高浓度抗体自造成损坏、一般需严格控制有机相比例。
（5）目标组分洗脱后，可将IAC净化柱进行活化再生，冷保存，以备再次使用。
可以看出，IAC净化柱的操作步骤和常规SPE小柱非常类似，但有几点差异。首先，根据选用定相和目标组分的结合力，SPE小柱的洗脱方式比较多样，可以洗脱目标组分保留杂质，或洗脱杂质保留目标组分，只要能将目标组分和样品基质尽量分开即可。但IAC的净化过程比较单一，总要保留目标组分而洗脱其他基质后再将目标组分洗脱收集。其次，两种净化方式的原理决定了IAC的选择特异性和富集效果远高于SPE。最后，SPE小柱通常只能使用一次，用后即弃。但IAC经过活化处理，可以多次使用且能在较高的柱容量下仍保高的回收率，在温和操作和适当活化处理的条件下，一根IAC净化柱可以重复使用10～20次。这在一定程度上降低了方法的平均使用成本。
免变亲和色请柱的主要应用领域在于制药和临床检测，包括抗原抗体的纯化和免疫分析等。但在色谱分析领域，也可利用这一技术制备具有超高选择性的净化小柱，用作样品的预处理，以备后续色谱定性、定量分析列。已有商品化AC预处理柱出售，如黄曲霉素免亲和柱等。但也因为选择性很高，富集效果很好，相应的，应用范围就相对较窄，处理成本也相对较高，一般只有在样品基质极为复杂、目标组分含量极低或其他预处理方法效果不好时才考虑采用。
目前作为样品预处理手段，免疫亲和色谱技术的发展重点还在探索IAC填料的制备，增强IAC净化小柱的柱容量和重复使用性，扩大方法的应用范围——包括单一抗体结合多种抗原，发展多种抗体，以及扩大目标组分和样品基质范围等。
更多的仪器学习资料，在仪器学习
三、分子印迹
分子印迹技术（ Molecular Imprinting Technique，MIT）的原理和免疫亲和色谱非常类似，它模拟抗原抗体的特异性相互作用，但主要利用小分子模板和目标组分间选择性极高的分子结构的互相嵌合，以目标分子为模板，通过与功能单体及交联剂共聚制备得到聚合物，再将目标分子除去后，利用聚合物中目标分子留下的空穴造成的“记忆”效应而实现从样品基质中对目标组分的提取。和1AC相同，MIT方法也具有预定的选择性和极高的特异性，也可以重复多次使用且寿命比IAC更长。和IAC不同的是，MIT更加灵活，适用范围更广，因为它可以根据目标组分的分子结构特性，比较容易地制造相应的分子印迹聚合物模板，并不受限于已有的模板。而且在具备和天然抗体同样的识别性能之外，还具有天然抗体所没有的抗腐蚀性能。制备更简单，机械强度高，稳定性好，在操作上也比IAC受限更少，对操作环境，如温度、离子强度，酸碱性，或是有机溶剂含量等并无严格要求，无需顾虑对固定相的损害，潜在应用范围更广。
除了直接作为样品分离手段，利用分子印迹色谱柱分离异构体和对映体等难分离物质外，还可以将分子印迹聚合物制备成SPE小柱，利用其独特的选择性对复杂样品基质中的痕量组分进行富集和萃取，然后再进行进一步的色谱分析。
MIT做固相萃取时，操作步骤和一般SPE并无二致，也需经平衡、上样、去除杂质和洗脱目标分子等步骤。发展方法时，每一步骤所用的溶液也都应进行优化，以实现最高的回收率和最好的杂质去除效果。
样品预处理是现代仪器分析领域中非常重要的一个组成部分，它占据了方法发展和常规分析过程中的大部分时间，最易引入偶然误差，甚至直接影响分析方法的可靠性和实用性。在现代仪器分析的发展进程中，新型样品预处理技术和策略也一直随之不断发展进步。
根据分离机理和介质的不同，本章简要介绍了几类常用样品预处理技术中较有代表性的操作方法，其中有经过数十年实践验证的经典方法，也有近年来发展迅猛的新兴方法。每种方法都有各自的特点和适用范围；对于同样的目标组分，可能有多种预处理方法能够满足分析要求。对于极端复杂基质，有时需要多种预处理方法结合使用。或者需要采用作用原理不同、操作手段互补的多种预处理手段，以实现对样品组分的全面了解。请读者根据实际操作中样品基质、目标组分、分析目的和分析成本等角度，选取最符合实验室要求的预处理方法或方法组合。还需强调，本章内容只涵盖了部分预处理手段，除此以外还有许多广泛应用并非常有效的方法可以用作气相色谱分析的预处理过程之中；其中一些在本书其他章节有更为详尽的阐述，如样品衍生化技术和一些传统简单但方便有效的方法（如顶空萃取法等）将在第十六章进行介绍，以供读者参考。
更多的仪器学习资料，在仪器学习
免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在第一时间进行处理。
声明：本站部分文章内容及图片转载于互联 、内容不代表本站观点，如有内容涉及侵权，请您立即联系本站处理，非常感谢！