细胞分选问答

样品制备篇（一）

多年的（20年）技术研发与支持职业生涯中，遇到了很多细胞分选的问题，不外乎三大类：样本相关、操作相关和流式分析相关。

今天先和大家聊一聊样本相关的坑，希望大家可以绕着走，不要入坑。细胞分选的样本可以千差万别，只要制备成单细胞悬液即可分选。制备单细胞悬液的方法和过程，也是多种多样。不一一列举。

常见的问题和解决办法如下：

一 癌症细胞系：

多数癌症细胞系是贴壁细胞，很多人研究癌症细胞系是想分选里面的肿瘤干细胞。

肿瘤细胞通常用胰酶消化成单细胞悬液，然后进行磁性细胞分选或者FACS流式分选。

客户经常发现细胞很容易聚集成团，分选效果差。尤其是某些分选时间较长的方法，还没分选完，细胞就成团了。

怎么破？

1 培养的密度很关键，不要长满再收细胞，长到50-80%就收。

2 在培养的过程中，在消化的过程中，不可避免地出现死细胞。死细胞会释放粘粘的DNA出来，溶液中的絮状物就是DNA了。这会导致非特异的结合，也是导致细胞成团的原因之一。

怎么破？DNAse 处理可以有效地降解粘粘的DNA和细胞成团现象。

3 细胞是活的（废话，死的我就扔了），活的就会变化。培养条件的不同，可能会导致细胞膜表面marker的表达下降甚至消失。

曾经有同学，信誓旦旦地不解地说到，文献就是用这个marker分的，我和文献用的相同的细胞系。用的同一个试剂盒。为什么我分不出来。是不是你们的试剂盒有问题。

首先，文献的可靠性姑且不论（有个 站叫科研界的纪委pubpeer了解一下）。

同样的细胞系，不同实验室，培养出的细胞maker表达的比例相差也是极大。

怎么破？

做流式先？先看看原本就不到1%阳性的率的细胞，还有阳性吗？

如果有，请继续。

否，请换个细胞。

4 肿瘤细胞消化收取：细胞膜表面的marker对不同的消化酶敏感性是不同的，有些时候，用的消化酶会把要用到的marker给消化掉。

怎么破？

换个酶试一下

二 外周血：

外周血虽然是常见的样本，但是目前的疫情形势下，获得新鲜的外周血几乎不可能了，除非是现场抽自己的血。

既然新鲜的外周血很难获取，一旦获得外周血，有很多人又好心起了副作用，比如把外周血放到冰箱里面。

如果当天就做实验，请不要把外周血放在冰箱。

第二天做也不要放冰箱，提取PMBC之后冻起来。

三 脾脏处理：

Mouse脾脏的处理简单快速，多数人采用研磨的方式。除了个别同学研磨的力度太大，时间太长，导致细胞大量死亡之外，其实大多数的同学脾脏的处理还是OK的。

但是要注意的是，从小鼠脾脏分选DC细胞的时候不能用研磨的方法，机械研磨损伤DC细胞，导致纯度大幅降低。

怎么破？

正确的做法应该是用酶消化的方法处理脾脏。好消息，EasySep mouse DC 细胞分选试剂盒自带脾脏消化buffer。

分选的坑—-流式篇

流式作为一种强大的细胞分析和分选的技术诞生于1965年，迄今已经有55年的历史。一个年过半百的老技术，竟然历久弥新，说明其强大的生命力和不断的技术进步。

本人才疏学浅，也并非流式专业出身，如有疏漏在所难免，贻笑大方，就当博君一乐。

流式细胞术，当然离不开流式细胞仪。随着我国能够生产流式细胞仪，价格一下子亲民了许多。几十万到上百万的都可以找到相应的型号。

作为细胞分选后纯度分析的手段，最基本的型号也可以满足基本的需求。如果实验室预算有限，最好先搞清楚流式细胞仪配置，激光和支持的荧光素。

流式和磁分选的前提是一样的，都需要单细胞悬液。在上一期样本制备坑里面，提到有些1）比例极低的细胞最好还是先做一下流式确定比例（点击此处回顾）2）有些易于凝集的细胞上流式之前，最好过滤一下。

在做流式分析鉴定的时候有哪些常见的坑呢？

1 没有对照，因此没法更加客观地设门。常见的对照有：阴性对照，同型对照，

2 荧光之间的补偿：大部分的荧光素在设备上已经调好了补偿，通常情况下是可以直接调用的。但是当细胞比较特殊的时候，比如补偿都是用外周血调的，而直接来了一个癌症细胞系，整个细胞的大小，表面marker的数量，都完全不同，这个时候最好重新调整一下补偿。

3 和流式老师的沟通：流式很少有自己操作的，基本有专门的老师负责。这个时候和操作的老师沟通清楚实验的设计，所用的荧光素，有哪些对照，有哪些单染管，还是非常有必要的。

4 电压的调整：一个配置不能通吃所有的实验，无需言明。在有些阴阳界限模糊的时候，调高一点电压，阳性更加阳性，而阴性还是阴性，就会得到漂亮的图。

简单调整电压，纯度从26.9%变成98.9%，就是这么神奇！

5 设门：流式虽然发展了50年，但是还是需要人工设门，仍然存在一定的主观性。设门要根据自己的实验，有根据，能自圆其说就行。

6 流式结果的解读：只要对照都设置了，结果是可信的，那就相信结果好了。至于为何与文献不一致，为何与其他人的不一致，自然有其原因，是寻找原因还是质疑结果？That’s a Choice. 比如DC 细胞本身形状不规则，在FSC/SSC上就能展现出来。比如分成两个群，有弱阳强阳，这个也是常有的事情。

7 回收率的计算: 最让人哭笑不得的是根据文献的比例计算理论产量，用实际的结果作为分子，经常说得率太低，真是“窦娥冤/逗鹅冤”，生物样本个体差异极大，同一个体不同时间的差异也极大。建议分选前的样本也染一下，看一下本次实验的比例作为计算分母的依据，然后得率就会正常。每一步的离心操作，都会造成损失，把所有的损失都算到分选的头上，也是有点逗鹅冤，流式分析的事情，拿分选前的样本计数做流式。