营养科技特医
研发●检测●生产●申 ●咨询
解决方案提供者
营养科技 lbyykj
工 程 师 介 绍
王巧娟
渭南师范学院化学专业
营养科技检测工程师
擅长特医食品中维生素 A、D、E的测定
维生素是维持机体正常生理功能及细胞内特异代谢反应所必需的一类微量低分子天然有机化合物。
维生素A与正常视觉有密切关系，为骨骼正常生长所必需，有助于细胞的增生与生长，并对上皮的正常形成，发育以及维持十分重要;维生素D能促进小肠对钙的吸收，其代谢活性物促进肾小管重吸收磷和钙，提高人体血浆钙和磷的浓度，或维持及调节血浆钙、磷正常浓度;维生素E能促进生殖,它能促进性激素分泌,使男子精子活力和数量增加;使女子雌性激素浓度增高,提高生育能力,预防流产。
方法原理
GB 5413.9-2010 《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定》
维生素 A、D、E的测定原理：
试样皂化后，经石油醚萃取，用液相色谱法分离，外标法定量。
检测试样
试样：肠内营养混悬液
试剂与材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的一级水。
? 无水硫酸钠：化学纯
? 乙醇：色谱纯
? 氢氧化钾：化学纯
? 石油醚：沸程30 ℃～60 ℃，化学纯
? 甲醇：色谱纯
? 维生素C ：分析纯
? 维生素A标准品：视黄醇
? 维生素E标准品：α-生育酚
? 维生素D3标准品：胆钙化醇
仪器和设备
? 二维高效液相色谱仪（一维：四元泵，二维：二元泵），带紫外检测器（一维）和二级管阵列检测器（二维）
? 旋转蒸发器
? 恒温震荡空气浴摇床：55℃
? 氮吹仪
? 超声波清洗器
? 天平：感量为 0.1 mg
? 聚四氟乙烯漏斗
? 500ml分析漏斗
? 快速滤纸
? 分液漏斗木头架
? 分液漏斗振摇器
分析步骤
皂样处理
1.皂样
流食35g /粉剂5-10g于250mL三角瓶
↓
4.5g抗坏血酸
↓
混合均匀 ，加入50ml（40 ℃左右）水溶解
↓
加入100ml无水乙醇，混合均匀
↓
盖上胶塞，避光超声10min
↓
加入氢氧化钾（KOH:H2O=1:1）25ml
↓
确保55℃下皂化55min
↓
(确保塞子塞紧，每隔20min观察，准备好冰水)
↓
结束后立即冰水立即冷却
2.提取
皂化液转入500ml分液漏斗，用150ml石油醚提取于分液漏斗振摇器振摇5min，静止5min分层
↓
分层后转移至另一个分液漏斗，加100ml石油醚同法萃取，合并醚液，
↓
水洗有机相3次至中性
↓
醚液过无水硫酸钠，用250ml鸡心瓶收集。
↓
40℃旋蒸蒸发
↓
旋蒸至1ml左右，用约5ml石油醚洗待测组分于50ml塑料离心管，氮吹仪吹干。
↓
用10ml色谱甲醇复溶解，涡旋混合仪混匀。
↓
样品过0.22μm滤膜，上HPLC，（-20℃保存3天）
注意：醚液合并后用石油醚洗分液漏斗3次洗液倒入有机相中；醚液过完后用石油醚洗分液漏斗3次洗液过无水硫酸钠。
操作注意事项
1.维生素A、D、E在强光下易分解，实验应在避光的条件下进行。
2.提取过程中石油醚其蒸气或雾对眼睛、粘膜和呼吸道有刺激性，应在通风橱中进行。
3.提取过程中应注意分液漏斗排气。
4.旋转蒸发时决不允许蒸干，以免被测样品含量有损失,氮吹干时，氮气不能开得太大，避免样品吹出瓶外，导致结果偏低。
5.实验过程中试样的转移需要完全彻底，以减少损失。
6.选择合适的皂化条件，如皂化剂浓度、皂化温度及皂化时间等使样品皂化完全的条件对测定结果影响很大。
7、醚液合并和过无水硫酸钠后用石油醚洗分液漏斗3次洗液倒入有机相中，防止漏斗壁沾有待测组分。
测 定
?色谱参考条件
维生素 A、D、E 测定色谱参考条件
色谱柱： 第一维色谱柱：C8柱， 50 mm ×4.6 mm， 2.7 μm，或具同等性能的色谱柱。 第二维色谱柱：PAH柱， 100 mm ×3.5 mm， 2.1 μm，或具同等性能的色谱柱。 Trap柱：C18柱， 5 mm ×4.6 mm，4 μm，或具同等性能的色谱柱。
检测波长：维生素A(325nm)；维生素🙁294nm)；维生素D:264nm。
波长检测方法：（0-4.5）min 325nm，（4.5-6）min 改变为294nm，5min左右切阀（时间长短0.4-0.45min）（6-15）min改变为264nm.
柱温：35 ℃±1 ℃。
进样量：10 μL。
时间：15min
流动相：一维:甲醇,水；二维:甲醇,乙腈
流速：一维:1ml/min；二维:0.3ml/min
维生素A D E 标准曲线的绘制
维生素标液矫正方法
注意：维生素A、D、E不稳定易分解，标准储备液使用前需要进行校正
C——维生素ADE浓度，单位为克每毫升（g/mL）；
A——维生素A、D、E的平均紫外吸光值；
V——加入标准储备液的量，单位为微升（μL）；
E——A、D、E维生素1 %比色光系数；维生素A：1835，维生素E：71
维生素D：462
维生素A D E 试样的测定
维生素 A、 D、E 标准曲线的绘制
?维生素A标准工作液浓度分别为0.5μg/ml，1μg/ml，3μg/ml，5μg/ml， 8μg/ml，10μg/ml（配置于棕色容量瓶，-20℃保存3个月）。
?维生素E标准工作液浓度分别为10μg/ml，50μg/ml，80μg/ml，120μg/ml,150μg/ml，220μg/ml（配置于棕色容量瓶，-20℃保存3个月）。
?维生素D标准工作液浓度分别为0.02μg/ml，0.04μg/ml，0.08μg/ml，0.15μg/ml,0.2μg/ml，1μg/ml（配置于棕色容量瓶，-20℃保存3个月）。
?分别将维生素 A、D、 E标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)。以峰高(或峰面积)为横坐标，以维生素 A、 D、E 标准工作液浓度为纵坐标分别绘制维生素 A、 E标准曲线。
?维生素 A、D、 E试样的测定，将试液注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)，根据各自标准曲线得到待测溶液中维生素A、D、 E的浓度。
注意：进样前先试二维的准确切阀时间，保证二维切阀时间在0.4-0.45min内
维生素A D E含量的计算
维生素A的计算 XA=CA*V/m*100
维生素E的计算 XE=CE*V/m*100/1000
维生素D的计算 XD=CD*V/m*100
注：XA(ug/100g)、XE(mg/100g)、XD(ug/100g)是样品中维生素A、D、E的含量重复性条件下获得的三次独立测定结果的算术平均值表示，结果A保留小数点后一位，D、E保留小数点后两位。CA、CE、CD分别为从标准曲线得出的样品中维生素A、D、E的浓度，V为样品测定中最终的定容体积，m为样品的称量质量。
维生素A、D、E加标回收率：
维生素A的回收率是87%
维生素D的回收率103%
维生素E的回收率是97.3%
声明：本站部分文章内容及图片转载于互联 、内容不代表本站观点，如有内容涉及侵权，请您立即联系本站处理，非常感谢！