新型纳米银-磷酸锆-中性红复合膜修饰电极，对过氧化氢电催化还原

摘要

制备了新型纳米银-磷酸锆复合材料，对中性红有强烈吸附。吸附的中性红表现出更强的氧化还原性，氧化还原中点电位与溶液中（pH 7）相比正移约200 mV。将辣根过氧化酶与复合材料共同修饰在电极表面制成酶电极，对H202有显著电催化还原作用。催化电流在2.5 *10- 6 ~ 2. 0 * 10- 3 moI/L 范围内与H202浓度成正比；H202检出限为2. 0* 10- 7 moI/L（S/N = 3）；传感器对1. 0 *10- 5 moI/L H202响应时间< 15 s；RSD 为1.4%（n = 10）。4℃保存6 个月该电极仍有85%以上初始响应。传感器有效消除了抗坏血酸等共存物质的干扰，回收率实验结果令人满意。

背景

中性红（NR）是优良电子转移介体，因水溶性大，制得修饰电极稳定性差，将NR 聚合在电极上可提高稳定性。聚NR 修饰电极对抗坏血酸、多巴胺及肾上腺素等有电催化作用。但是在维持酶催化活性的pH 下，单体和聚NR 还原电位都太负，催化底物还原时共存物质干扰严重。许多酶如辣根过氧化酶在过低电位下会丧失催化能力，使得NR 不能用于构筑H202传感器。

磷酸锆（ZP）是优良的离子交换剂，常用来固定电子转移介体。介体固定在ZP 上，氧化还原中点电位［Em =（Epa + Epc）/2］正移约300 mV，可有效电催化氧NADH。将物种包合到类似基质中成为调制电对电位的有效途径。包合后介体的氧化还原电位不随底液pH 而改变，十分有利于构筑酶电极。

纳米金属胶粒在水溶液或表面活性介质中具有高度反应性，能催化氧化还原反应，但其在溶液中易聚集丧失催化活性。Sun 等以沸石为载体制备纳米金属微粒稳定性好，为光催化分解水的机理研究提供了模型。此法制备纳米金属粒子需要多步骤，可能使金属离子未被完全还原，限制纳米金属颗粒催化应用。本实验通过直接浸渍法制备纳米银

和磷酸锆复合材料

，并将NR 吸附在复合材料中固定在电极表面。复合膜中ZP 大大正移了NR 氧化还原电位，有效防止了其流失。复合膜中纳米银了ZP 吸附NR 能力，促进了NR 氧化还原反应并保持了ZP 电位调制能力。吸附态NR 对H202具有显著的催化还原能力。传感器表现出宽的线性范围和快的伏安响应，并具有良好的稳定性和重现性，特别是大大降低了共存物质干扰，具有极好的选择性。

试验

1、H202传感器的制备

直接购买绵竹耀隆化工磷酸锆ZP；纳米银和磷酸锆复合材料制备请联系耀隆化工。将纳米银磷酸锆（Ag0n -ZP）复合物在水中充分溶胀，制成40 g/L 胶体。取此胶体50μL 加入10μL 3% PVA、20μL 含0. 1 moI/L KCI Tris-HCI 缓冲液（pH 7），3 mgHRP，3 mg BSA 和10μL 5%戊二醛，迅速搅拌均匀。取10μL 该混合液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，自然干燥成膜。再置于5.0 X 10- 4 moI/L NR 溶液中浸15 min，染料分子吸附到修饰膜中，制成H2O2生物传感器。传感器水洗后置于含0.1 moI/L KCI Tris-HCI 缓溶液（pH 7）中，在- 0. 8 ~ 0. 8 V 间循环扫描至信号电流稳定为止。电极不用时保存在4C PBS 缓冲液中（pH 7）。

2、测定方法

（1） 循环伏安法三电极系统插到Tris-HCI 缓冲液中，通入高纯氮除氧后在- 0. 80 V ~ 0. 80 V 间作循环伏安图；

（2）恒电位电流法溶液同（1），插入三电极系统，恒定电位于- 0. 4 V，调整基线稳定后迅速加入H2O2标准溶液；溶液通氮气除氧后，测定其电流值，此值与基线电流差值为信号电流。

结果与讨论

1、吸附在Ag0n-ZP 膜中NR 电化学性质

吸附在纳米银Ag0n -ZP 膜中NR，在含0.1 moI/L KCI Tris-HC（I pH 7）缓冲液中! 为100 mV/s时，Em约为- 0.35V，比NR 正移约200 mV，故适合于电催化辣根过氧化酶对H2O2还原反应。吸附态NR Em随υ增大，略有负移，ΔEp增大，表明吸附过程不可逆。吸附态NR 的ipa、ipc与υ 和υ?都为非线性关系，表明电极反应由吸附和扩散过程共同控制。溶液中NR Em随支持电解质pH 呈线性变化，而吸附在膜内的NR Em不随支持电介质的pH 改变而变化，在pH 4 ~ 9 范围内始终保持在- 0.35 V。另外，峰电流也不随溶液pH 而改变，这有利于构筑化学和生物传感器。

2、Ag0n对ZP 吸附NR 能力的增强作用

ZP 修饰电极和ZP-Ag0n修饰电极在5. 0 X 10- 4moI/L NR 溶液中浸泡15 min 前后，在Tris-HCI 缓冲液中的循环伏安图（见图1）。

与ZP 修饰电极相比，在ZP-Ag0n修饰电极上，NR 氧化还原峰电位略微负移，而峰电流却明显提高，说明膜中Ag0n大大增强了ZP吸附NR 能力。Ag0n在测定电位范围内也有电活性，氧化峰尖而窄（ Epa≈0. 08 V），无还原峰。这些电活性的纳米银微粒大大提升了NR 峰电流，其主要原因是：

（1）纳米级银簇具有卓越的吸附性能，它作为共吸附剂大大提高了电极表面NR 局部浓度；高度分散的纳米Ag0n带有过剩负电荷，与荷正电的NR 分子存在静电相互作用，使NR 与Ag0n结合更紧密，并且在膜中增加了新吸附点，提高了NR 电化学响应；

（2）纳米银簇过剩自由电子向吸附的NR 转移时在粒子与溶液间产生电位差，该电位差在单质银氧化过程中还原所吸附的NR，因而提高了吸附态NR 电活性。

3、H202生物传感器制备

预备实验发现酶容易脱落流失，传感器信号不稳定。本实验将酶、戊二醛和BSA 掺到ZP-Ag0n复合物胶体中，滴涂到电极表面干燥成膜，再在NR 溶液中浸15min，将介体和酶固定于膜中。此法制备传感器酶层不易脱落，且方便了NR 在酶和电极间进行电子传递。另可吸附NR 均匀分散于膜内，更多介体可以接触到酶活性中心，制得的传感器响应更灵敏。

4、传感器对H202催化还原

图2（a）是ZP-Ag0n -HRP 和ZP-Ag0n -HRP-NR 电极在加入H2O2前后的循环伏安图。由图（a）可知膜中Ag0n也能电催化H2O2还原，但不明显，与NR 电催化作用相比可忽略不计。由图2（b）可知，当无H2O2时，ZP-Ag0n -HRP-NR 电极只表现出NR 的氧化还原峰（1），加入H2O2后，NR 还原峰明显增加，而还原电位基本不变，证明此还原峰仍为NR 还原所致。相同条件下基体电极和ZP-Ag0n -NR 膜修饰电极（不含酶）对H202无响应，表明固定在修饰膜内的HRP 对H202有明显催化还原作用，膜内的NR 是该反应体系有效电子转移介体。还原电流增加幅度与H202浓度成正比，可用于H202定量测定。反应机理推断如下：

5、酶和介体用量的影响

膜中固定酶用量增加，传感器响应灵敏度增加。但酶量过大又使得线性范围变窄，本实验选择3 mg（90μL）HRP 为最佳用量。将ZP-ag0n -HRP 修饰电极置于5.0 X 10- 4 moI/L NR 中浸泡15 min 即达到饱和吸附，故选择最佳吸附时间为15 min。生物传感器在pH 5 ~ 7 范围内对H202有好的响应，pH 7.0 为最佳。

6、工作电位的选择

当工作电位在- 0.3 ~ – 0.7 V 间变化时，工作电位越负，灵敏度越高，同时溶液中共存电活性物质也越容易还原，测定干扰越大。实验选择– 0. 4 V 为最佳工作电位

7、传感器响应时间

8、传感器稳定性

由于ag0n与NR 分子强烈的相互作用，大大增强了膜对染料的吸附能力，ZP-ag0n -NR 修饰电极与ZPNR电极相比，显著提高了稳定性。另外，ag0n还增强了膜机械强度，H202传感器连续工作10 d 电流响应基本不变。传感器在4C冰箱中放置6 个月，其活性保持85%以上。在含1. 0 X 10- 5moI/L H202溶液中，RSD 为1.4%（n = 10），说明传感器重现性很好。

9、传感器抗干扰能力

传感器在Tris-HCI 缓冲液中固定H202为0.5 mmoI/L，E为- 0.4 V，对抗坏血酸、蔗糖、葡萄糖、L-乳酸、柠檬酸、L-色氨酸和NO-3、F- 、K+ 、Ca2 + 、Mn2 + 、Cu2 + 可能造成的干扰进行实验。因为ZP 正移了吸附态NR 氧化还原电位，此H2O2传感器有效避免了大多数共存物质干扰。

10、校准曲线和回收率

由于NR 快速有效地传递电子，该传感器灵敏度很高。图3 是传感器对不同浓度H2O2响应的电流-时间曲线（E 为- 0.4 V）。校准曲线由不同浓度H2O2计时电流曲线作出，线性范围为2. 5 X 10- 6 ~ 2 X 10- 3mol/L；检出限为2 X 10- 7mol/L（S/N = 3）。校准曲线按浓度数量级分段绘制，如表1。在Tris-HCI（ pH 7）缓冲液中，E 为- 0.4 V，用标准加入法进行回收率实验，回收率在97.0% ~ 102.0%之间，结果令人满意。

结论

磷酸锆（ZP）是优良的离子交换剂，常用来固定电子转移介体。介体固定在ZP 上，氧化还原中点电位［Em =（Epa + Epc）/2］正移约300 mV，可有效电催化氧化NADH。将物种包合到类似基质中成为调制电对电位的有效途径。包合后介体的氧化还原电位不随底液pH 而改变，十分有利于构筑酶电极。