生物安全实验室技术规范——万融实验

实验室伤害以及与工作有关的感染主要是由于人为失误﹑不良实验技术以及仪器使用不当造成的。本章概要介绍了避免或尽量减少这类常见问题的技术和方法。

实验室中标本的安全操作

实验室标本的收集、运输和处理不当，会带来使相关人员感染的危险。

标本容器

标本容器可以是玻璃的，但最好使用塑料制品。标本容器应当坚固，正确地用盖子或塞子盖好后应无泄漏。在容器外部不能有残留物。容器上应当正确地粘贴标签以便于识别。标本的要求或说明书不能够卷在容器外面，而是要分开放置，最好放置在防水的袋子里。

标本在设施内的传递

为了避免意外泄漏或溢出，应当使用盒子等二级容器，并将其固定在架子上使装有标本的容器保持直立。二级容器可以是金属或塑料制品，应该可以耐高压灭菌或耐受化学消毒剂的作用。密封口最好有一个垫圈，要定期清除污染。

标本接收

需要接收大量标本的实验室应当安排专门的房间或空间。

打开包装

接收和打开标本的人员应当了解标本对身体健康的潜在危害，并接受过如何采用标准防护方法的培训，尤其是处理破碎或泄漏的容器时更应如此。标本的内层容器要在生物安全柜内打开，并准备好消毒剂。

移液管和移液辅助器的使用

1、应使用移液辅助器，严禁用口吸取。

2、所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染。

3、不能向含有感染性物质的溶液中吹入气体。

4、感染性物质不能使用移液管反复吹吸混合。

5、不能将液体从移液管内用力吹出。

6、刻度对应（Mark-to-mark）移液管不需要排出最后一滴液体，因此最好使用这种移液管。

7、污染的移液管应该完全浸泡在盛有适当消毒液的防碎容器中。移液管应当在消毒剂中浸泡适当时间后再进行处理。

8、盛放废弃移液管的容器不能放在外面，应当放在生物安全柜内。

9、有固定皮下注射针头的注射器不能够用于移液。

10、在打开隔膜封口的瓶子时，应使用可以使用移液管的工具，而避免使用皮下注射针头和注射器。

11、为了避免感染性物质从移液管中滴出而扩散，在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸，使用后将其按感染性废弃物处理。

避免感染性物质的扩散

1、为了避免被接种物洒落，微生物接种环的直径应为2～3mm 并完全封闭，柄的长度应小于6cm 以减小抖动。

2、使用封闭式微型电加热器消毒接种环，能够避免在本生灯的明火上加热所引起的感染性物质爆溅。最好使用不需要再进行消毒的一次性接种环。

3、干燥痰液标本时要注意避免生成气溶胶。

4、准备高压灭菌和／或将被处理的废弃标本和培养物应当放置在防漏的容器内（如实验室废弃物袋）。在丢弃到废弃物盛器中以前，顶部要固定好（如采用高压灭菌胶带）。

5、在每一阶段工作结束后，必须采用适当的消毒剂清除工作区的污染。

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装有冻干感染性物质安瓿的开启

应该小心打开装有冻干物的安瓿，因为其内部可能处于负压，突然冲入的空气可能使一些物质扩散进入空气。安瓿应该在生物安全柜内打开，建议按下列步骤打开安瓿：

1、首先清除安瓿外表面的污染。

2、如果管内有棉花或纤维塞，可以在管上靠近棉花或纤维塞的中部锉一痕迹。

3、用一团酒精浸泡的棉花将安瓿包起来以保护双手，然后手持安瓿从标记的锉痕处打开。

4、将顶部小心移去并按污染材料处理。

5、如果塞子仍然在安瓿上，用消毒镊子除去。

6、缓慢向安瓿中加入液体来重悬冻干物，避免出现泡沫。

装有感染性物质安瓿的储存

装有感染性物质的安瓿不能浸入液氮中，因为这样会造成有裂痕或密封不严的安瓿在取出时破碎或爆炸。如果需要低温保存，安瓿应当储存在液氮上面的气相中。此外，感染性物质应储存在低温冰箱或干冰中。当从冷藏处取出安瓿时，实验室工作人员应当进行眼睛和手的防护。以这种方式储存的安瓿在取出时应对外表面进行消毒。

对血液和其他体液、组织及排泄物的标准防护方法

设计标准防护方法（其中包括“常规预防措施”）以降低从已知或未知感染源的微生物传播危险。

标本的收集、标记和运输

1、始终遵循标准防护方法；所有操作均要戴手套。

2、应当由受过培训的人员来采集病人或动物的血样。

3、在静脉抽血时，应当使用一次性的安全真空采血管取代传统的针头和注射器，因为这样可以使血液直接采集到带塞的运输管和／或培养管中。用完后自动废弃针头。

4、装有标本的试管应置于适当容器中运至实验室（运输要求见第15 章），在实验室内部转运也应这样（见本章关于“在设施内转移标本”部分）。检验申请单应当分开放置在防水袋或信封内。

5、接收人员不应打开这些袋子。

打开标本管和取样

1、应当在生物安全柜内打开标本管。

2、必须戴手套，并建议对眼睛和黏膜进行保护（护目镜或面罩）。

3、在防护衣外面要再穿上塑料围裙。

4、打开标本管时，应用纸或纱布抓住塞子以防止喷溅。

玻璃器皿和“锐器”

1、尽可能用塑料制品代替玻璃制品。只能用实验室级别（硼硅酸盐）的玻璃，任何破碎或有裂痕的玻璃制品均应丢弃。

2、不能将皮下注射针作为移液管使用（参见本章“避免感染性物质的接种”部分）。

用于显微镜观察的盖玻片和涂片

用于显微镜观察的血液、唾液和粪便标本在固定和染色时，不必杀死涂片上的所有微生物和病毒。应当用镊子拿取这些东西，妥善储存，并经清除污染和／或高压灭菌后再丢弃。

自动化仪器（超声处理器、涡旋混合器）

1、为了避免液滴和气溶胶的扩散，这些仪器应采用封闭型的。

2、排出物应当收集在封闭的容器内进一步高压灭菌和／或废弃。

3、在每一步完成后应根据操作指南对仪器进行消毒。

组织

1、组织标本应用福尔马林固定。

清除污染

建议使用次氯酸盐和高级别的消毒剂来清除污染。一般情况可使用新鲜配制的含有效氯1g/L的次氯酸盐溶液，处理溢出的血液时，有效氯浓度应达到5g/L。戊二醛可以用于清除表面污染。

对可能含有朊蛋白物质的防护

朊蛋白（prion，也称作为“慢病毒”）与许多疾病相关，包括某些传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies，TSEs）、克雅病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD；包括新的变异型）、格-施-沙综合征（Gerstmann-Str?ussler-Scheinker syndrome）、人类致死性家族性失眠症和库鲁病、绵羊和山羊的瘙痒病、家畜的牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy，BSE），以及鹿、糜鹿及貂的传染性脑病。尽管克雅病已经传播到了人类，但是还没有证据证实发生过由这些病原体所引起的实验室感染。不过，在操作已感染或潜在感染的人或动物材料时，还是应当谨慎注意防护。当进行与传染性海绵状脑病有关材料的工作时，应根据微生物因子和所研究标本的特征来选择生物安全水平，并向国内权威机构咨询后进行。在中枢神经系统组织中发现有最高浓度的朊蛋白，动物研究还表明在脾脏、胸腺、淋巴结和肺内可能也有高浓度的朊蛋白。最近的研究表明，舌和骨骼肌组织也存在潜在朊蛋白感染的危险。

由于很难彻底灭活朊蛋白，因此尽可能地使用一次性器具，在生物安全柜的工作台面使用一次性防护罩，这些措施都非常重要。

主要应该预防的是避免污染材料的食入或实验室工作人员的皮肤刺伤。由于朊蛋白不能被普通的实验室消毒和灭菌方法所灭活，故应当遵循以下防护措施：

1、强烈建议使用专用仪器设备，亦即不与其他实验室共用仪器。

2、必须穿戴一次性防护服（隔离衣和围裙）和手套（对病理学家而言，要在两层橡胶手套间戴钢丝 手套）。

3、强烈建议使用一次性塑料制品，它们可按干废弃物处理并丢弃。

4、由于灭菌的问题不能使用组织处理机（tissue processors），应当使用广口瓶或烧杯（塑料材质）替代。

5、所有操作必须在生物安全柜中进行。

6、必须特别小心以避免产生气溶胶、意外食入、划伤或刺伤皮肤。

7、福尔马林固定的组织，即使在长时间福尔马林的浸泡后，仍应视作具有感染性。

8、含有朊蛋白的组织标本暴露于96%甲酸1 h 可以基本失活。

9、实验台垃圾，包括一次性手套、隔离衣和围裙，均应当采用多孔负荷蒸汽灭菌器在134～137℃高压灭菌18 min 一个循环，或高压灭菌3 min 六个循环，然后再焚烧。

10、钢丝 手套或Kevlar 手套等非一次性用具，均必须收集起来清除污染。

11、污染有朊蛋白的感染性废液应当用含20g/L（2%）有效氯的次氯酸钠（终浓度）处理1h。

12、多聚甲醛熏蒸的方法不能降低朊蛋白的滴度，朊蛋白对紫外线照射也具有抵抗力。但是，安全柜仍必须用标准方法来清除污染（如甲醛蒸气），以灭活可能存在的其他微生物因子。

13、朊蛋白污染的生物安全柜和其他表面可以采用含20g/L（2%）有效氯的次氯酸钠处理1h来清除污染。

14、HEPA过滤器摘除后需要在至少1000℃的温度下焚烧。在焚烧之前推荐进行下述处理：

a. 在摘除前用喷漆喷头给过滤器的裸露表面喷雾，

b. 在摘除过程中将过滤器“装袋”，以及

c. 从工作柜中除去HEPA过滤器，这样可以不污染难以操作的安全柜压力排风系统。

15、用具应当用含20g/L（2%）有效氯的次氯酸钠浸泡1 h，然后用水彻底清洗再进行高压灭菌。

16、不能高压灭菌的用具可以反复用含20g/L（2%）有效氯的次氯酸钠润湿超过1h 来进行清洁，并要求用水冲洗以清除残留的次氯酸钠。