一、方法论证规范
表1 严格HPLC标准方法的论证方案
注：主要用于日常工作或质量监控方法。
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二、方法论证中的问题
随着方法建立的进行，可能会出现各种问题，表2中列出其中的一些问题及可能的原因。其他问题还包括：
①开始时色谱图中有的谱峰可能比所期望的要宽（塔板数低），或谱峰严重拖尾；
②在方法应用中还会发现用同一（或不同）厂家的“规格相同”色谱柱替代原柱后，分离情况会变得难以接受；
③常规实验室无法用（规格相同的）另柱重复方法；色谱柱寿命短（如进样不足100次即不能再用）；
④（同一色谱柱）重复进样的色谱图不一样，定量精度较差；
⑤保留时间从一系列运行的开始直至结束一直漂移；
⑥在后面样品的色谱图中可能出现其他峰干扰被测物测定。
表2 方法建立和论证期间可能出现的问题
将长期使用的常规方法，最好先对这些问题进行预测并加以改善，方法重现性差会直接影响质量控制或生产实验室的工作。
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三、准确度、精密度和线性范围
HPLC定量技术的方法论证要求给出方法的准确度、精密度和线性范围。准确度定义为测量值与真实值接近的程度，真实值可通过各种方法来确定，准确度值通常用相对误差表示：
（1）
式中，Er为相对误差；xi为测量值；μ为真实值。
精密度是指同一样品多次测量结果的重复程度，包括使用不同的仪器、样品制备、实验室以及不同的操作人员等在一天或经过数天所得到结果之间的重现性，通常用相对标准偏差表示：
（2）
式中，`x 表示n次测量结果的算术平均值；xi表示第i次的测量结果；n是总的测量次数。
线性范围是指响应值与样品浓度的校正曲线近似成直线关系的范围，即数据满足线性方程的程度，每一种被分析物在较宽的浓度检测范围有良好的线性响应是定量分析方法的关键。响应值与样品浓度之间的线性关系可以表示为：
（3）
式中，y为检测器的响应值；x为样品组分的浓度；m为直线的斜率；b为直线的截距。理想情况下，b≈0，即响应值与浓度呈正比例关系，这种情况下测量更精密且计算容易，同时可用较少的标准样品数据确定方程中的系数。
对于稀溶液样品，UV检测器的响应值与溶质浓度间的关系符合Beer定律，即正比例关系。线性校正也可以说明系统在所研究的浓度范围内运转良好。此外，线性方法（b≈0）可以用一个（最好为两个）点提供快速方便地检验校正的准确度。假如新校正结果较原有值有大于2σ的偏差则要求重新校正。b≠0的线性响应或者非线性响应对某些方法可能更合适，但数据处理过程将较为复杂。
四、检测限和定量限
分析物最小可测量浓度［或称作检测限（LOD）］是指能被可靠检测的最小浓度。LOD与体系的信号和噪声有关，通常被定义为信噪比（S/N’）至少为3：1的峰。图1给出了典型的检测器信号是噪声三倍的例子，噪声（峰对峰）为10个单位而信号为30个单位。
图1 峰的信噪比（S/N’）＝3
（a）检测限（LOD）＝3：1；（b）定量限（LOQ）＝10：1
最大定量限是指使用定量方法能够可靠测定的最大浓度。最小定量限［亦被称为定量限（LOQ）］是指在某一指定水平的准确度和精密度下能够可靠定量的最低浓度。
LOQ有三种不同的表达方式：
①类似于LOD，但要求信噪比（S/N’）至少为10；
②定义某一精密度，然后根据实验确定相对于该水平的精密度需要多大的峰高；
③假定基线噪声近似为一宽度为4个标准偏差（N’＝4σ）单位宽度的高斯分布。若S/N’＝5，用峰高测量估计的最好精密度约±10％。
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最大定量限通常由检测器的线性范围决定（即检测器随溶质浓度的增加不再呈线性响应）。最大和最小定量限决定了方法应用的浓度或质量范围。假如需要更高浓度样品的定量分析，将样品稀释至可检测的范围内是有效扩大检测范围的一种简便、有效的手段。
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