AAV载体不同生产平台细胞培养的工艺要点以及挑战

目前基因治疗领域常用的病毒载体有腺病毒、慢病毒、重组腺相关病毒（rAAV）以及逆转录病毒等，其中AAV因其免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、表达稳定以及特异性强等优势脱颖而出。据NIH统计，已有超过200个正在进行或已完成的基因治疗临床试验使用rAAV载体。尽管rAAV基因治疗药物已显示出巨大的前景，但是强大、稳健而且可放大的基因载体生产制造工艺一直是CGT行业的痛点。

目前rAAV生产平台主要有三种：三质粒瞬转体系（TransientTransfection, TT）、杆状病毒表达载体体系(Baculovirusexpression vector，BEV)和包装细胞体系(Packaging/Producercell line，PCL)。这篇短文将聚焦三大生产体系细胞培养的工艺要点以及所面临的挑战。

1. 三质粒瞬转法～HEK293（TransientTransfection, TT）

目前，绝大多数以重组腺相关病毒(rAAV)为基础的基因疗法仍然使用20多年前开发的“三质粒转染（tripletransfection）”技术。三质粒包括腺病毒Helper质粒（包含E2a/b、E4和VARNA基因）、表达质粒（包含转基因序列，两端是ITR）以及辅助质粒（包含Cap（编码病毒衣壳蛋白）&Rep（参与病毒的复制）基因），只需要将三个质粒转染到宿主细胞（大多数情况下HEK293细胞），就可以组装成rAAV病毒颗粒。

图一：三质粒转染系统（HEK293），是目前用于临床/研究级的rAAV生产的主流技术。

在TT系统中，又包含两种方式。贴壁TT(Adherent TT，aTT)和悬浮TT（suspension TT，sTT）。aTT适用于实验室、小规模1期临床试验以及用药剂量相对较低的疾病，如视 膜变性等。此外，aTT周期短，生产灵活，有利于FIH研究（First in Human）的快速启动，使其成为一个非常有吸引力的制造系统。然而，aTT工艺难以放大，研究人员转向开发悬浮（sTT）HEK293系统。

sTT不仅具有可放大性以及总体产量高的优势，还可以实现无血清培养，可减少病毒、真菌和支原体等微生物污染的风险，更符合监管要求，已经成为目前rAAV大规模生产的首选方式。另外搅拌槽生物反应器（STR）的应用，使得sTT更利于放大。这种方式减少了培养液处理需求，因此是一种更理想的解决方案。以宜明细胞的无血清细胞培养平台工艺为例，该平台拥有国际一流标准的cGMP真核细胞培养生产线十数条，拥有成熟的大规模细胞培养工艺，培养规模为50L-200L-500L-2000L。该平台独立驯化的悬浮细胞293XS细胞株培养密度可达1E7cells/ml，可实现50L-200L-500L-2000L规模细胞培养，AAV的产率大于1E14VG/L。

rAAV生产的另一众所周知的挑战是转染复合物形成。目前大规模生产主要采用PEI法转染，将PEI添加到质粒DNA中形成基因传递纳米颗粒。这些纳米颗粒非常不稳定，时间依赖性的颗粒生长可能降低细胞摄取和转染效率。质粒作为转染的初始物料之一，起着举足轻重的作用，也是TT体系的另一瓶颈，即大量GMP级别质粒的需求。虽然CDMO服务商的参与即可解决这一问题，但是“需求量大”这一事实极大的提高了基因治疗的成本。宜明细胞的GMP质粒生产平台采用高密度发酵工艺，发酵全过程无动物源成分、无抗生素，产量可以超过1g/L。改良的连续流碱裂解工艺，全程参数控制，裂解菌量可线性扩大。另外创新的两步柱层析纯化工艺回收率可高达到60%，纯度超过90%。高产量，高回收率，高纯度的质粒大幅度降低了客户的成本。

2. 杆状病毒表达载体体系～Baculovirus/Sf9(Baculovirusexpression vector，BEV)

这一体系是应用杆状病毒表达载体(BEV)系统感染昆虫细胞Sf9，是一种替代哺乳动物包装细胞系的生产方案。整个系统包含两种BEV，其中一个BEV携带两侧有ITRs的目的基因，另一BEV则携带rep/cap基因。这两种BEV同时感染Sf9即可组装AAV。由于杆状病毒具有辅助功能，因此BEV系统与可以稳定表达rep的Sf9细胞相结合，可用于灵活的、高滴度的大规模载体生产。BEV体系安全性好,感染效率高,生产工艺较之sTT更易放大，有更高的体积生产率优势。

但是有研究发现，BEV体系生产的rAAV发生了与293生产体系不同的衣壳蛋白翻译后修饰（
post-translationalmodifications,PTMs）。这一差异是否会影响载体趋向性和转导效率还需要进一步验证。除此之外，杆状病毒多重感染会导致载体蛋白VP1、VP2和VP3比例不一致。尽管如此，BEV/Sf9系统仍然是一种颇有吸引力的大规模临床级载体生产策略。

3. 包装细胞法&诱导型包装系细胞法（Packaging/Producer cell line， PCL；induced Packaging/Producer cell line，iPCL）

PCL的应用可以追溯到25年前那是首次将PCL生产的rAAV用于人临床试验，以治疗成人囊性纤维化。PCL系统被认为是最具成本效益、最可扩展的，以及批次间一致性最好的生产平台。在PCL中，rep/cap和GOI元件可以稳定地整合到一个受纳宿主细胞(如HeLa细胞)中，只需腺病毒感染即可诱导产生重组AAV。这一技术避免了多质粒转染步骤，简化了病毒载体生产步骤，极大地降低了降低成本。文献记载的成功的PCL生产最高可达2000L。

最近，研究人员还开发出一种可诱导的包装细胞系（inducedPCL，iPCL）。这一表达系统利用化学诱导型启动子，通过添加化学诱导剂（如四环素）来开启或关闭基因表达。iPCL通过使用基因表达开关，将rAAV的产生可以分为两个阶段：细胞生长阶段和病毒载体产生阶段，以减少目的基因表达的副作用，如细胞死亡、生长延迟等。

虽然PCL/iPCL系统为rAAV生产提供了一种更可扩展的和稳定的方法，但需要大量的时间和资源来生成稳定的细胞系。iPCL的构建比sTT的实施更加困难重重。而且iPCL细胞系的稳定性尚无临床证明。在细胞扩增过程中，基因拷贝数的变化/基因表达的缺失也会影响最终产品产量和质量。

结论

几大系统都有各自的优势和挑战，没有一种生产系统是完美的，三者相比如下表所示。

表一：几大主要AAV生产体系优劣的比较

总之，在确定某个项目的“最佳”生产平台时，要评估总体产品需求、临床试验时间表、目标患者群规模，然后再结合各个平台的风险考虑其效益。另外，关于各大平台工艺的参数对rAAV安全性和有效性的影响尚未完全知晓，因此，在更明确的指导方针建立之前，在从首次人体临床试验转向关键的临床试验和商业生产之前，应该谨慎地评估在各个生产平台之间的切换。