凝胶渗透色谱柱的选择

经典的简易凝胶渗透色谱柱大多采用玻璃管作为柱管材料，一般玻璃柱管耐压是3000~4000kPa，不能承受更高的压力，无法满足高效凝胶渗透色谱柱的需要。而不锈钢柱管的耐压可达几万kPa，甚至更高，所以玻璃柱管逐渐被不锈钢柱管取代。目前，GPC所用的柱子大部分采用不锈钢柱管，根据不同的色谱分离条件，来选择合适填料规格的色谱柱。

1.色谱柱的选择

目前随着GPC技术的不断发展和更新换代，在一般的凝胶渗透色谱仪中，凝胶渗透色谱柱的长度多在150~600mm之间，柱内径约为2.1~30mm。过分长和粗的色谱柱在装柱过程中，对装柱技术的要求更高，想要装出既均匀又紧密而达到高效的色谱柱，难度较高。实验室经常选用2~5根甚至更多根色谱柱串联起来使用，也可将同一型号的2根或2根以上的色谱柱串联使用，这样可以增加柱容量，扩展色谱柱的线性分离范围，得到高的分离效率。比如技术人员为了要增加对低分子量部分的分离效率，可以通过增加装有小孔径凝胶的色谱柱数量来达到分离低分子量物质的目的。

实验要求凝胶渗透色谱柱的柱管内表面必须光滑平直，这样流动相在色谱柱内就不会形成沟流或死域，也就是说在该区域内，流动相可能停滞不前或因沟流使流速比柱中其他部分快，这些都会影响色谱柱的分离效率。凝胶渗透色谱柱内径的大小也是影响分离效率的一个因素，初期的GPC经常使用2~5cm内径的粗柱，由于GPC技术发展不够成熟，导致分离效率低。现在高效GPC通常使用2.1~8mm内径的不锈钢色谱柱。在制备型GPC仪中，所用的柱内径较大，一般在10~30mm之间。

选择和搭配合适的凝胶是提高分离效率的关键，因为GPC柱的标定曲线在选择性渗透区域内代表着组分分子量的对数logM和淋洗体积V e之间的线性函数关系，标定曲线一般都呈现出一个横放“S”形状，如图5-11所示。

由图可见，三种(A、B和C)凝胶分离两个化合物(分子量分别为106和104)。用B组色谱柱可以得到比较高的分离度，因为标定曲线在这两个化合物组分的分子体积范围内，不但呈直线关系，而且直线的斜率比较小，淋洗体积差△Ve比较大，分离度RS值也比较大。即两个化合物分大小都靠近分离范围的中间，两个峰间隔△VB大，可以得到较好的分离。而对于凝胶A，两个化合物的洗脱靠近了它的排斥极限，故两个峰尖的间隔△VA小，分离度肯定不好。如果用凝胶C，则两个化合物的洗脱体积全靠近该凝胶的全渗透极限，峰间隔△VC很小，两峰仍不能达到很好地分离。

前面已讲过，为了使色谱柱性能有比较宽的线性分离范围，常常需要串联2~5根装有不同型号凝胶的色谱柱。在搭配柱子时，不但需要考虑凝胶柱子的分子量分离范围，使被测聚量分离范围之内(图5-12) ，而且还需要考虑凝胶渗透色谱柱标定曲线在所测定的分子量分布范围内，logM 与V e之间保持直线关系。这样在最后对色谱图进行数据处理和把淋洗体积转变成分子量时，就比较方便。因此，多柱串联体系既可用于改善分子大小范围不同的化合物的分离度，也可以改善分子量大小相似的两化合物的分离度。前者可用不同型号的凝胶柱，后者亦可用同一型号规格的柱子串联使用。但是，需要指出的是，在同一根凝胶柱中不能填装不同规格的凝胶，因为这种柱子不适合按上述方法串联使用，更重要的是会降低柱效。

Kwok等人对串联柱的非加和性进行了研究，认为串联柱的柱效并不等于各个色谱柱柱效的简单加和。假定串联柱组共有n根柱子(1，23….. n)以同一种化合物来测定各色谱柱的柱效，所得的淋洗体积依次为V 1， V2， V3，…… Vn，峰宽若以标准偏差来表示各为σ1，σ2，σ3，……σn。色谱柱串联后的淋洗体积和峰宽分别为V和σ，由于溶剂的压缩系数很小，

。可以看出，这里峰宽的加和性只对σ2适用，而不适用于σ。因此，串联柱的总柱效。

式(5-4) 表明，串联柱的柱效并不是各个柱的柱效的简单加和。若用塔板高度Hi来表征柱效时，Hi= Li/Ni，亦可证明在特殊情况下，当每根柱的Hi和Vi/ Ni相同时，

才能成立。但在一般情况下，

。通常，由于各根色谱柱的直径和长度是相同的，因此柱子的Vi和Li是基本相同的，然而由于装柱条件控制的不同，每根色谱柱的Ni有可能并不相同，在这种情况下，式(5-4)可以简化为：

由式(5-5)可以方便地计算出串联柱组的总柱效。在某些情况下，个别色谱柱的柱效特别低，如果将其串联在柱组中，不但不会增加柱效，有时还会使总柱效降低。例如在有n根色谱柱的串联柱组中，除一根柱效过低的柱子外，其它n-1根柱子的柱效相似都有Ni左右的柱效。如果这根过低柱效的色谱柱比其它柱子的柱效小X倍，即它的柱效为Ni /X，根据式(5-5) 可以算出串联柱组的总柱效为：

从式(5-6)可看出，那根过低柱效的色谱柱对串联柱组不贡献任何塔板数的条件为：

从式(5-7) 可明显地看出，当这根色谱柱的柱效比一般色谱柱的柱效低(2n-1)/(n-1)倍时，这根柱子将对串联柱组不贡献任何柱效；如果低于(2n-1)/(n-1)倍时，它的加入，不但不增加任何柱效，反而会使总柱效降低。因此装柱条件控制不好而导致柱效过低的柱子，必须予以重装。

无疑，色谱柱的装填优劣可直接影响色谱分离效率。分离度是表征GPC柱对不同试样分离能力的一种量度，也是衡量色谱柱性能的重要参数，分离度RS经过推导可写成下列形式：

式中Kd1、Kd2分别为组分1和2的分配系数，相当于组分1和2实际进入凝胶孔洞体积Vi’

和凝胶孔洞总体积Vi之比，即：

k’是凝胶的分离容量因子，是凝胶孔洞总体积Vi和凝胶颗粒的间原体积V0的比值，即k’=

Vi/V0。而N是表征色谱柱柱效的理论塔板数。

我们可以从三方面来分析讨论式(5-8) ：

(1)分配系数Kd的选择：由于

即分离度RS与Kd2/Kd1成正比。色谱柱的选择性不仅与凝胶性质和粒度有关，而且还与色谱柱装填的均匀紧密程度有极大的关系。

(2)色谱柱的分离容量：

，即分离度RS与色谱柱的分离容量因子k’成正比。因为k’=Vi/V0， 所以，要求柱子应有较大的Vi和较小的V0。

(3)色谱柱的柱效：

，即RS与理论塔板数N的平方根成正比。

由此可见，要得到高的分离度RS，应着重考虑色谱体系的选择，用适宜的凝胶填料得到均匀而紧密装填的色谱住是最关键的一环。

对于k’值很接近的两个以上组分，通常用高效液相色谱无法分离，除了改变流动相的组成可能有一定的效果外，还可增加色谱柱的理论塔板数，为此通过减小固定相的粒度和增加柱长能达到目的。如果再考虑用多根凝胶渗透色谱柱串联，从而获得更高的柱效，则k’值相近而分子尺寸大小不同的组分，能够用GPC进行分离和测定。由此可见，GPC为各种物质的分离提供了一个新的独特的手段。

我们知道，GPC柱的柱效对于分离样品的能力影响极大，一个色谱峰的峰底宽度的实际值是由色谱柱效所决定的。

Karkland提出的表示色谱柱住效的公式为：

式中

H——为理论塔板高度；

V——为流动相的线速度；

Dm一一为溶质分子在流动相中的扩散系数；

Dsm——溶质分子在多孔微粒填料的微孔液相中的扩散系数：

Ce、Cm、Csm——分别为塔板高度方程中色谱带展宽的系数；

dp——为凝胶微粒的直径。

由方程(5-9) 可以看出，式中每一项都有颗粒直径dp，这反映了GPC中固定相颗粒直径对H的影响之重要。因此，减小凝胶颗粒直径，降低流动相线速，以及提高溶质分子的扩散系数，则有利于使H减小。理论塔板高度H较小，意味着色谱柱的理论塔板数较大，会使色谱峰变窄，可以获得较好的分离效果。