动物源性食品中兽药残留的检测——喹啉类药物残留

喹啉类药物（quinoxaline）是具有喹啉-N1，N4-二氧化物基本结构的一类化学合成的动物专用药，具有广谱抗菌、提高饲料转化率和促生长作用。1965年德国拜耳公司以邻硝基苯胺为原料合成喹乙醇（olaquindox），1968年美国辉瑞公司合成了卡巴氧（carbadox）。目前应用的喹啉类药物主要包括喹赛多（cyadox）、卡巴氧、喹乙醇、乙酰甲喹（mequindox）、喹烯酮（quinocetone）、氰喹多司（cinoquidox）和肼多司（drazidox）等。对该类药物的研究和应用大致分为三方面:第一是对动物疾病的治疗作用，第二是在畜牧生产上的促生长作用，第三是残留、毒性的研究。本部分将阐述喹啉类药物的理化性质、代谢与毒理学、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。

1 理化性质和用途

常用药物的化学结构式和化学名称如表5-30所示。

喹啉类药物大多难溶于水，溶于二甲基亚砜、二甲基甲酰胺等有机溶剂，多呈黄色或淡黄色结晶，遇光不稳定。喹乙醇为浅黄色结晶粉末，无臭，味苦。不溶于多数有机溶剂，溶于热水，微溶于冷水，在甲醇、乙醇和氯仿中几乎不溶，熔点（熔融分解）207～213℃，在常温下相当稳定，在40℃时可保存3年以上，在70℃条件下亦可保存半个月以上不被氧化，90℃经30min无变化，在混合物或片剂中稳定性也很好，可与矿物质、微量元素等常用饲料添加剂和中草药配伍混用。对光敏感，光照易分解为棕色或深棕色。喹烯酮为黄色结晶或无定形粉末，无臭无味，微溶于甲醇、乙醇；在氯仿、二氧六环、二甲基亚砜中溶解。熔点为186～189.0℃，熔融同时分解。对光敏感。

卡巴氧和喹乙醇使用较早。20世纪70年代以来曾被广泛应用，美国和加拿大主要将卡巴氧做猪饲料添加剂使用，喹乙醇主要在澳大利亚、巴西、日本及我国等应用。由于其毒性作用，欧盟于1998年禁止了卡巴氧和喹乙醇的使用，2004年起加拿大禁止卡巴氧用于供人类食用家畜。美国也限制卡巴氧仅用于育成猪（体重小于35kg）的抗菌治疗。卡巴氧用作促生长和抗菌作用饲料添加剂，饲料添加浓度为50mg/kg，4月龄的猪开始使用，宰前4周停药。我国禁止使用卡巴氧。2001年农业部168号公告?饲料药物添加剂使用规范?规定喹乙醇只能用作育成猪的饲料添加剂，饲料添加量用量为25～50mg/kg，禁用于禽。此外，我国相继研制和批准使用乙酰甲喹和喹烯酮。

2 代谢和毒理学

研究者早在20世纪60年代末就开始进行喹啉类药物代谢相关研究。卡巴氧在猪体内很快脱氧，生成脱二氧卡巴氧（desoxycarbadox），同时侧链也很容易断裂，转化成喹啉-2-羧酸（QCA）。后来有研究表明卡巴氧及其代谢产物都可以通过一些途径转化成QCA，说明卡巴氧在动物体内可能首先且易发生脱氧反应。以14C标记法研究卡巴氧在猪、鼠和猴体内的代谢和排泄，饲喂数周后，猪尿液中检测到15种代谢物，停药后72h内，74%药物从猪尿液中排出，17%药物从粪便中排出。鼠和猴尿液中检测到其中13种，另外两种之一是甘氨酸-喹啉-2-羧酸结合物。代谢途径如图5-43所示。其中脱二氧卡巴氧和肼（hydrazine）具有遗传毒性和致癌性。最终代谢物QCA无致癌和致突变毒性。

喹乙醇用作促进动物生长的饲料添加剂，拌入饲料中饲喂后猪吸收迅速，超过90%的口服药量从尿道中排出，其余从粪便中排出。给药后1～2h血药浓度达峰，然后迅速下降。药物可分布于全身各组织器官，但浓度很低。口服2mg/kg，肝肾浓度可达110μg/kg和52μg/kg，肌肉浓度仅为9μg/kg。28d后，肾脏和肌肉浓度仅为0.9μg/kg和0.5～0.8μg/kg，肝脏浓度稍高，为2μg/kg。口服后70%药物以原型从尿液中排出，主要代谢物为还原产物，如1，4-mono-N-oxides（16%），其余为喹啉酸衍生物。肝微粒体体外孵育体系中的代谢研究表明，喹乙醇主要代谢途径是N→O基团还原，其次包括侧链氢基氧化、N4-脱羟乙基化和羟化，且存在种属差异。大鼠的N→O基团还原和羟化能力最强，鸡的氧化能力最强，喹乙醇N→O基团还原和N-氧化可相互转化。

喹烯酮口服不易吸收，猪口服的生物利用度为0.5%，鸡的生物利用度为3%，且大部分以原型从消化道中排出，尿液中仅检测到3-甲基喹啉-2-羧酸（MQCA），组织中无原型残留。喹烯酮在肝微粒体体外孵育体系中的主要代谢途径是N→O基团和羰基的还原，其次还包括羟化、烯醇式转化和双键还原。与同类药物代谢途径类似，在动物体内代谢广泛，生成多种代谢物，初级代谢为脱氧代谢生成脱一氧和脱二氧代谢物，次级代谢为侧链代谢或侧链断裂。喹烯酮在鸡体内代谢先还原脱去一个配位键的氧形成单氧物（1-单氧喹烯酮、4-单氧喹烯酮），然后还原再脱去另一个配位键的氧形成脱二氧喹烯酮，最后经过氧化水解生成代谢物喹羧酸（3-甲基-喹啉-2-羧酸）。代谢途径如图5-44所示。

喹赛多在猪体代谢途径与卡巴氧和喹乙醇相似，猪体内喹赛多可以代谢成N4-脱一氧喹赛多和脱二氧喹赛多，脱二氧喹赛多为主要代谢产物之一。喹赛多在肝微粒体体外孵育体系中主要代谢途径是N→O基团还原和酞胺键水解，其次为羟化。

放射性标记乙酰甲喹在大鼠、猪和鸡体内的代谢，证明乙酰甲喹与同类产品相似，在6h最先检测到脱二氧乙酰甲喹，脱二氧乙酰甲喹在体内保留时间最长，为主要代谢产物之一。乙酰甲喹在肝微粒体体外孵育体系中主要代谢途径是羧基和N→O基团的还原，其他代谢途径包括羟化，其主要代谢物在不同动物间存在种属差异，大鼠N→O基团还原能力最强。

喹啉类药物在动物体内代谢特点存在共性，其化学结构中的喹啉环上的N→O键较活泼，先发生脱氧反应，生成脱氧代谢物，再发生侧链断裂反应，生成其他产物。同一化合物在不同动物体内的代谢途径基本相似，但主要代谢物和代谢物的量存在明显种属差异。大鼠对喹啉类的N→O基团还原和羟化能力最强，猪对其羧基还原和酰胺键水解能力最强，鸡则对其羟基氧化能力最强。不同化合物由于侧链不一样，代谢途径存在明显差异。

氧化应激是指体内活性氧化物质的产生和抗氧化防御体系之间失衡，从而导致组织损伤。含有N→O基团的化合物在脱氧过程中会产生一些羟基自由基和毒性中间物自由基，它们与DNA或蛋白质共价结合引起毒性。喹啉类药物在脱氧代谢过程中也伴随羟基自由基产生，对细胞组织有很强的破坏作用，可能引起DNA损伤毒害作用。喹啉类药物毒性顺序是卡巴氧＞喹乙醇＞喹赛多，主要影响DNA损伤的恢复。已有研究证明乙酰甲喹和喹乙醇100μmol/L对猪肾上腺皮质细胞具有氧化应激毒性，当此类药物与猪肾上腺皮质细胞一起孵育，可以产生稳态活性氧，造成氧化损伤，导致谷胱甘肽（GSH）下降和超氧化物歧化酶（SOD）上升，而且具有一定的时间和剂量依赖性，随时间延长毒性增加，喹乙醇产生自由基较多，乙酰甲喹产生较少。

喹赛多、乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮和卡巴氧的毒性具有较大差异。N→O基团是引起喹啉类药物致癌、致畸、致突变等毒害作用的原因之一。若把N→O基团脱去，则无致突变性。脱去氧的速度越快，则诱变性丧失越快，说明它们的诱变性与N→O基团存在密切关系。埃姆斯（Ames）试验、哺乳动物体外诱变细胞试验、哺乳动物体内诱变试验和基因突变试验均证实了喹乙醇有致基因突变的作用。毒理研究发现其有明显的致癌、致畸、致突变、光敏和肾上腺皮质损坏等毒副作用。喹乙醇致癌作用具有种属品系差异，对哺乳动物致癌性还需要进一步研究；对某些品系鼠具有遗传毒性和致癌性，但肿瘤为良性，确切机制不明。喹乙醇和卡巴氧遗传毒性程度不同，卡巴氧对啮齿类动物具有致癌性和致突变性，喹乙醇具有遗传毒性但不具有致癌性（仅对啮齿类动物致癌）。需要特别注意的是生产工人的暴露安全性。

不同动物种属对喹乙醇的毒性敏感程度有较为明显的差异，禽类敏感性较高（艾维茵肉鸡内服LD50＝288.4mg/kg），鱼类敏感性则相对较低（银鲫肌内注射LD50＝407.4mg/kg）；喹乙醇对小鼠的蓄积系数为3～3.3，为中度至明显蓄积。按照100mg/kg和200mg/kg的添加剂量连续饲喂断奶仔猪39d，发现喹乙醇对其生长和肝肾功能均有一定毒副作用。

3 国内外限量要求

FDA未能制定喹乙醇MRL，仍然许可喹乙醇暂时使用。加拿大从2007年开始对进口猪肉执行卡巴氧“零”残留标准。1998年，欧盟禁止卡巴氧和乙酰甲喹做饲料添加剂，2001后，加拿大禁止卡巴氧销售。鉴于脱二氧卡巴氧被怀疑具有致癌性，在动物体内持续时间更长，2003年JECFA建议卡巴氧-2-羧酸不适合作为卡巴氧残留标志物，脱氧卡巴氧更为适合。我国近年来合成的喹赛多和喹烯酮的残留限量需要进一步研究。有关限量规定如表5-31所示。

4 残留分析

由于喹啉类药物的毒性作用机制尚不完全明确，应按规定使用，避免食品安全事故发生。开展喹啉类药物残留分析方法研究具有重要意义。喹啉类残留分析研究的对象主要包括原型及其代谢残留标志物。

4.1 提取与净化

4.1.1 饲料样品

饲料是喹啉类药物在动物体内造成残留的源头。饲料中该类药物简便、灵敏的分析方法可有效监测药物的使用情况，及时预警。饲料中喹啉类药物分析方法研究始于20世纪70年代，用于提取饲料中的喹啉类药物，主要用甲醇、乙腈、二氯甲烷及混合溶剂等，净化主要采用氧化铝固相萃取或液-液分配的方法。Roybal等用25%酸化甲醇-三氯甲烷提取饲料中卡巴氧，然后通过酸-碱溶液液-液分配和氧化铝小柱净化后用LC测定。Lin等用95%二甲基甲酰胺过夜提取猪饲料中的卡巴氧、乙酰甲喹等5种药物，耗时较长。Ramos等采用四氯化碳-二甲基甲酰胺（80∶20，V/V）混合溶剂在60℃浸泡猪饲料30min后，离心提取猪饲料中的卡巴氧和喹乙醇。提取溶剂中卤代烃毒性较大，样品提取时间长。McGary采用二甲基甲酰胺-二氯甲烷提取猪饲料中的卡巴氧和磺胺二甲嘧啶，简化了提取步骤，但提取溶剂中仍有卤代烃。Graaf等采用二甲基甲酰胺-水混合溶剂提取猪饲料和猪肠道内容物中的卡巴氧和脱二氧卡巴氧，简化了提取步骤。Horpe等采用水直接提取猪饲料中的喹乙醇，回收率达90%左右，操作比较简单。Aerts等先将饲料润湿后用甲醇-乙腈（50∶50）提取，提取液用氧化铝净化，样品用LC-UVD检测。施杏芬等采用三氯甲烷-甲醇（3∶1，V/V）提取饲料中卡巴氧。欧阳华学等采用甲醇-水（50∶50，V/V）提取畜禽饲料中的喹乙醇，提取液直接进HPLC分析。杨文军等又对畜禽饲料中喹乙醇的提取溶剂进行优化，以5%甲醇-水混合溶剂在室温条件下振荡提取效果最好。

多残留分析是残留分析方法发展趋势，Boscher等建立用甲醇-乙腈-偏磷酸缓冲液超声提取饲料中包括卡巴氧和喹乙醇在内的13类兽药的LC-MS/MS测定方法。Wu等采用甲醇-乙腈-水（35∶35∶30，V/V）超声波提取饲料中卡巴氧、喹乙醇、喹赛多、喹烯酮和乙酰甲喹5种喹啉类药物，回收率均达到85%以上。5种喹啉类药物在饲料中的检测限（CCα）低于0.45mg/kg，定量限（CCβ）低于0.75mg/kg。喹啉类药物与饲料形成氢键的可能性不高，如果再在提取溶剂中加入酸，反而更加大了形成氢键的可能，降低了药物提取率，所以提取溶剂不需要酸化。提取溶剂中含有水和甲醇可以削弱所分析的药物与饲料基质间氢键作用，提高提取回收率。试验结果显示，甲醇-乙腈-水（35∶35∶30，V/V）提取饲料中5种喹啉类药物效果最佳，回收率达到85%以上。

超声波的机械机制使溶剂对细胞壁渗透力更大，强化细胞内外的质量传输。同时也可破坏基质细胞的细胞壁，使细胞内含物更易释放。超声波空化可以产生微冲流，能有效打破边界层，使扩散速度增加，从而使萃取或浸出速度提高2～10倍。加速溶剂萃取（ASE）是一种在高温和高压下用有机溶剂萃取固体或半固体样品的自动化方法。喹啉类药物特性使得该类药物不宜在高温高压下进行样品提取。液-液萃取和固相萃取净化技术在样品前处理步骤中应用较多，液-液萃取所需时间较长，喹啉类药物不稳定，样品净化过程不适合选用，固相萃取在喹啉琳类分析方法研究中应用较多，多采用氧化铝层析柱净化。

4.1.2 动物组织样品

动物组织残留标志物与饲料不同，喹啉类作为养殖动物的药物添加剂，卡巴氧和喹乙醇在动物体内迅速生成脱一氧和脱二氧等产物，并转化为喹啉-2-羧酸（QCA）或3-甲基喹啉-2-羧酸（MQCA），其化学结构式见图5-45。QCA或MQCA在动物体内消除速度最慢，分别是卡巴氧和喹乙醇的残留标志物。这两种残留标示物均呈现酸性特征，常利用这一特征进行残留分析。国内相继研制成功的喹赛多、喹烯酮和乙酰甲喹等产品的残留标志物有待确定。

测定动物可食性组织中喹啉类药物残留物需要采取碱解、酸解或酶解方法，断裂其与蛋白质等的结合键，然后用乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷等溶剂提取，提取液再进行液-液萃取和固相萃取净化后测定。Hutchinson等采用热碱液水解猪肝脏样品45min，用浓盐酸酸化提取液后用乙酸乙酯反萃取卡巴氧及其代谢物。Huang等用3mol/L氢氧化钠溶液100℃水解血液和组织中喹赛多30min，水解提取物用盐酸中和后反萃取至乙酸乙酯，乙酸乙酯中药物再反萃取至柠檬酸缓冲液中后测定，组织样品再经过离子交换柱净化，用甲醇-水溶液洗脱，洗脱液用盐酸酸化与三氯甲烷液液萃取净化后检测。在水解加热过程中，动物组织样品中蛋白质也被分解，产生较多小分子的氨基酸，增加了样品测定干扰。试验表明碱水解的方法样品共提物较多。为简化步骤，采用蛋白酶酶解，结合液-液分配方法净化。酶解的方法比碱水解具有较多优点，可以选择性破坏药物与组织的结合键，减少样品基质共提物，但是酶解的方法耗时较长，一般要在16h以上。Huang等采用碱液水解组织样品后用乙酸乙酯提取喹烯酮和脱二氧喹烯酮、3-甲基喹烯酮-2-羧酸，提取物用异丙醇纯化和乙酸乙酯-柠檬酸缓冲液（pH＝6）提取后，用MCX小柱净化，用LC-UVD检测。Li等采用类似方法分别建立了血浆和鸡组织中喹烯酮及其代谢物LC-MS测定方法。采用偏磷酸溶液水解动物组织样品，提取液直接用有机溶剂萃取净化，可以简化操作，避免强酸和强碱的使用。偏磷酸可有效沉淀蛋白质，样品色谱峰干扰明显少于碱性水解。Horie等用0.3%偏磷酸-甲醇（7∶3）脱蛋白质提取肝脏中卡巴氧及其代谢物卡巴氧-2-羧酸和脱二氧卡巴氧，提取物用OasisHLB小柱（60mg）和液-液分配净化，回收率为70.2%～86.3%，检测限为1ng/g。Wu等采用5%偏磷酸-10%甲醇溶液提取鱼肉中的QCA和MQCA，提取液用乙酸乙酯反萃取后用MAX小柱净化后测定。Aerts等采用甲醇-乙腈提取猪肾脏和肝脏中卡巴氧及其3种代谢物，提取物用氧化铝-弗罗里硅土固相小柱和异辛烷净化后测定。样品提取溶剂中应适当加入甲醇以提高药物的溶解性。甲醇的含量对药物提取率也有影响，含量过高会导致溶液中偏磷酸溶解度降低，影响蛋白质沉淀效果。甲醇含量超过10%，回收率反而低于60%，原因可能是甲醇含量过高降低了偏磷酸的溶解度，影响了药物在组织蛋白质中的释放能力，从而降低了样品中药物残留的提取回收率。试验表明，5%偏磷酸-10%甲醇混合溶剂提取效果最佳。Boison等与Zhang等用稀甲酸灭活猪组织和鱼肉中的生物酶，用蛋白酶消化后用稀盐酸溶液提取，提取液用MAX固相萃取柱净化，分别建立了液质联用方法测定QCA和MQCA。

4.2 测定方法

喹啉类药物和代谢物QCA和MACA属中等极性，大多选用普通反相液相色谱（LC）柱，洗脱条件选用甲醇、乙腈和水组成常见流动相。通过调节三者比例和梯度条件，各药物可得到较好分离。该类药物及其代谢物的共平面共轭结构具有紫外吸收特性。QCA和MQCA都有3个较强的吸收峰。吸收波长分别为204nm、245nm和320nm。可选择320nm作为测定波长。早期饲料中的药物，许多文献 道用LC-UVD，波长采用280nm以上可减轻基质的干扰。代表性药物光谱图如图5-46所示。Aerts等用氢氧化钠溶液柱后衍生，420nm波长检测。药物测定限为1～5mg/kg，回收率和变异系数分别为81%～87%和4%～10%。

由于该类药物的毒性特征，许多国家严格控制应用和残留，LC-MS检测方法受到关注，成为检测研究的主流。Horie等建立了LC-ESI-MS方法测定猪肌肉和肝脏中卡巴氧及其代谢物卡巴氧-2-羧酸和脱二氧卡巴氧，色谱分离采用CadenzaCD-C18column（10cm×2mm内径）色谱柱，0.01%乙酸-乙腈梯度洗脱，卡巴氧-2-羧酸采用负离子检测[M-H]－，脱二氧卡巴氧采用正离子检测[M＋H]＋。Zhang等建立了动物组织中乙酰甲喹及其代谢物MQCA残留。用UPLC-ESI-MS/MS检测，每个样品用时小于5min，检测限和定量限分别为0.1ng/g和0.25ng/g，回收率为92.7%～104.3%。Boison等用LC-MS/MS测定卡巴氧和乙酰甲喹及其代谢物。Hutchinson等建立了测定QCA和MQCA的LC-ESI-MS/MS方法。采用稳定氘代同位素内标，QCA检测产物离子为m/z102和75，MQCA为m/z145和102。CCα和CCβ分别为QCA0.4mg/kg和1.2mg/kg，MQCA为0.7mg/kg和3.6mg/kg。Bosion等采用Nova-PakC18（4μm，2.1mm×150mm），流动相采用甲醇-乙腈-0.3%甲酸水溶液梯度分离，监测离子:脱二氧卡巴氧（175＞129，231.0＞143.0，231.0＞102.0）、QCA（175＞129，175＞102）和MQCA（189＞1430，189＞102）；检测限分别为0.25μg/kg、0.3μg/kg和0.3μg/kg。

该类药物的代谢物为羧酸类结构，气相色谱（GC）测定往往需要衍生化后进行。Lynch等建立肝脏中卡巴氧及其代谢物的毛细管GC检测方法。Della等采用MTBSTFA衍生QCA，气相色谱柱采用DB-5MS毛细管柱（30m×0.25mm内径，0.25μm厚），质谱检测用SIM，检测离子m/z288、289和290，定量限为0.7g/kg。

免疫分析技术是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析，免疫反应涉及抗原和抗体之间高度互补的化学、静电、氢键、范德华力和疏水域的相互作用，因此具有选择性强和灵敏高的特点，非常适用于复杂基质中痕量组分的分离和检测。喹乙醇没有合适的活性功能基团可直接连接到载体蛋白，需先将其羟基改造为羧基后才能与载体蛋白偶联。已 道制备的喹乙醇单克隆抗体的抗体特异性较好，与卡巴氧交叉反应率为5.2%，与其他药物交叉反应率均小于0.1%，抗原合成路线见图5-47。宋春美等采用间接竞争ELISA测定喹乙醇，检测限为3.58ng/mL，IC50为12.9ng/mL，并建立了鸡肉中喹乙醇残留的ELISA检测方法。当喹乙醇添加量为10～100μg/kg时，回收率为60%～90%。