动物源性食品中兽药残留的检测——阿维菌素类药物残留

阿维菌素类药物（AVMs）属于大环内酯类药物（MALs），是一类土壤链霉菌的天然发酵产物。AVMs对线虫和体外节肢动物有较强的驱杀作用，是目前应用最广泛的抗寄生虫药物和植物杀虫剂之一。

目前已批准7种AVMs用于动物治疗，包括阿维菌素（avermectin，AVM）、依维菌素（ivermectin，IVM）、多拉菌素（doramectin，DOR）、埃普里诺菌素（eprinomectin，EPR）、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（emamectinbenzoate，EMA）、莫西菌素（moxidectin，MOX）和塞拉菌素（selamectin，SEL）。其中SEL主要用于伴侣动物；而EPR是唯一被批准用于治疗泌乳期奶牛寄生虫感染的AVMs，且无休药期；EMA被批准用于治疗鲑养殖中的海虱感染。虽然AVMs的作用剂量较小（μg/kg级），但是AVMs作为脂溶性药物，在动物体内的残留时间较长，因此WHO将其列为高毒化合物。动物组织中AVMs残留一直是兽药残留研究领域重点监控对象之一。

本部分综述了AVMs的理化性质、药理与毒理学、危害、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，重点介绍动物性生物基质中AVMs残留的提取、净化等前处理方法，以及各种检测技术，包括免疫分析法、液相色谱等，以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。

1结构及理化性质

AVMs属二糖苷衍生物，基本结构为五环十六元的内酯环，其上连接有三个主要基团:二糖基团（通过苷键在C13位上连接α-β-齐墩果糖-α-β-齐墩果糖基）、苯并呋喃和螺酮缩醇结构（分别位于C6～C8和C17～C19）（表5-35），而SEL只含有一个单糖基团。AVM是根据C5位上取代基的不同、C22和C23之间单双键的差异及C25位上取代基的不同，分别用A、B，1、2，和a、b的组合来命名。天然的AVM发酵产物有8种组分:A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b，其中A2a、B1a和B2a含量最高。而B组分的药效较A组分要强，B1组分药效较B2组分略强，a组分与b组分有相似的生物活性。AVMB1是天然提取AVM纯化后的主要成分，又称为abamectin（ABM），B1a所占比例在80%以上，B1b少于20%。IVM是将AVMC22和C23间的双键加氢饱和后获得的半合成衍生物，其即保持了AVM优良的抗虫活性，同时降低了毒性。DOR是在AVM的C25上引入一环己烷基而完成，其优越性在于消除率低、生物半衰期长，因而生物利用率更高。EPR是在AVM的4”端引入一个乙酰氨基而成，与其他AVMs显著不同的是EPR的奶/血分配系数低（仅为017），在奶中的残留量低，应用于泌乳奶牛而无需休药期，此外EPR在肌肉中残留量低，应用于肉牛也无需休药期。SEL是在DOR的C22～C23位上加氢合成的，可用于对其他AVMs敏感的柯利牧羊犬。

AVM和IVM在常温、避光、密封或pH5～9环境下相当稳定。分析中应避免强碱和酸性条件。AVM为淡黄至白色结晶无味粉末，熔点155～157℃，蒸汽压1.5×10－9Pa，密度1.16±0.05g/cm3（21℃）。

AVMs含有糖链并且相对分子质量较高，基本上属于弱极性物质，水溶性极低（溶解度仅为0.006~0.009mg/L），易溶于有机溶剂，如氯仿、甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯、环己烷、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。AVMs对酸敏感，如用稀酸处理，则可引起C13位上第一糖基的断裂。此外，该类化合物对光敏感，如用紫外线照射，则可导致8、9位和10、11位之间双键的异构化。C2上的质子由于受羰基等吸电子基团的影响较为活泼，在强碱条件下能发生差向异构化（2-差向异构体），同时C3～C4间双键可移至C2～C3（Δ2-异构体）。Δ2-异构体结构和性质与原药相似，是一个良好的分析内标物，而长时间强碱处理将发生C2～C7芳环化、内酯环打开等一系列变化。

2 药理学与毒理学

2.1作用机理

AVM与美贝霉素类在抗寄生虫方面具有共同的作用机制。但起初，人们认为与AVM相比，美贝霉素类有不同作用机理，这主要是因为美贝霉素类仍可抑制对AVM已耐药的寄生虫。

目前认为AVMs的作用机制为其对受体通道的作用，从而抑制神经递质的传导。在脊椎动物的神经、肌肉传导中，γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸通过增加氯离子来阻断神经和肌肉细胞中的电信号传导。对于无脊椎动物，GABA和谷氨酸也通过一个类似的机制来抑制电信号。在这个过程中，抑制性神经递质（GABA、甘氨酸或谷氨酸）从突触前的神经末端释放，结合到突触后受体蛋白，此受体蛋白含有一种固有的氯离子通道。当抑制性神经递质与受体结合后，通道被打开，大量氯离子涌入突触后神经元，造成神经膜电位超极化，致使神经膜处于抑制状态，从而阻断神经冲动传导而使昆虫麻痹、拒食、死亡。

而AVMs与这些受体的高亲和力结合是一个不可逆过程。目前已 道可与AVMs结合的受体有GABA受体、谷氨酸受体和甘氨酸受体。而只有在非常高的剂量下，才能观察到AVMs与GABA受体的相互作用，这表明AVMs的作用机制并不仅仅是通过与这些受体相互作用来实现的。研究发现AVMs与甘氨酸受体的结合只发生在脊椎动物的肌肉，而不是无脊椎动物。与之相反，AVMs只与无脊椎动物肌肉组织的谷氨酸受体结合而不是脊椎动物。Schaeffer和Haines的研究表明，在治疗剂量下IVM对谷氨酸受体具有很高的亲和力。电学研究表明，这一结合引起细胞膜电导发生不可逆的升高，导致肌肉组织特别是咽泵（pharyngeal pump）出现麻痹。因此他们认为AVMs的抗虫机理与谷氨酸受体的相互作用密切相关。谷氨酸受体是AVMs最重要的作用靶位，但很难说是AVMs唯一的作用机制。

2.2抗虫活性

IVM是第一个广谱的可同时抗线虫和节肢动物的抗寄生虫药物。其独特的广谱抗虫活性使得AVMs被归为抗内外寄生虫药物。不过AVMs对吸虫和绦虫无效。自从IVM问世后，许多替代药物也已被相继开发。每种药物都有它自己的抗虫谱，显示在低剂量（5μg/kg）下对某些寄生虫具有活性，而对其他寄生虫杀灭要求更高剂量（100μg/kg）。基本上来说，各种AVMs在200μg/kg的剂量下均具有广谱活性。因而在动物食品的生产中，为达到广谱活性，大多数产品均使用200μg/kg来作为其治疗剂量。然而，由于其对动物本身仍具有毒性危险，因而一些窄谱的产品会使用低剂量，特别是针对某些具有牧羊犬血统的犬。

2.3代谢消除

研究表明AVMs在动物体内代谢较少，多数经粪便排出，而且其组织残留主要为原型药物，因此一般均以AVMs原型作为残留标志物。生物转化的主要场所是肝脏和脂肪，在这两种组织中药物分布浓度最高，消除速率也最为缓慢，故肝脏和脂肪常作为检测AVMs残留的靶组织。AVMs主要代谢产物有24-羟甲基代谢物、3”-O-去甲基代谢物等。对于ABM和IVM，在牛、绵羊和大鼠肝脏中的主要代谢产物为24-羟甲基代谢物；在脂肪中的主要代谢产物为24-羟甲基代谢物与脂肪酸的酯化产物，其极性较母药略有降低。而在猪脂肪中的主要代谢产物为3”-O-去甲基代谢物，由于其难与脂肪酸反应形成极性低的酯化产物，因此脂肪中含量较少。而DOR在牛和猪中的主要代谢产物均为3”-O-去甲基代谢物。MOX的代谢产物主要为单羟基代谢物（C14位羟基化）；EMA在鲑中的主要代谢产物为N-去甲基代谢物。

AVMs在动物组织中残留的时间与药物种类、给药方案和动物种属相关。研究表明皮下注射给药的残留时间要比使用浇泼剂长，所以皮下注射给药的休药期一般长达34～45d。而使用IVM、MOX和EPR浇泼剂的休药期分别为28d、14d和17d。不过，DOR浇泼剂的休药期也需要35d。相比之下，猪在皮下注射时IVM的休药期仅为28d，而肌内注射DOR的休药期长达49d。

2.4毒性

WHO将AVMs列为高毒化合物，但其治疗剂量应远低于其毒性剂量。一般来说AVMs对于大多数可批准使用的物种是相对安全的，如IVM对反刍动物、马属动物、猪和大多数的犬的安全范围大于10mg/kg。但有 道表明某些具有牧羊犬血统的犬（如柯利牧羊犬）和默里灰牛（MurrayGreycattle）分别对IVM和ABM敏感，容易受到其毒性影响。AVMs对不同动物的毒性不同，例如口服IVM对大鼠、小鼠、比格犬的LD50分别为25mg/kg、50mg/kg、80mg/kg，柯利牧羊犬仅为0.01～2.5mg/kg。AVMs种类不同，毒性也不同。AVM对大鼠的口服LD50为12～24mg/kg，而IVM为25～40mg/kg，而SEL对柯利牧羊犬的毒性是IVM的1/10。EPR对大鼠的急性经口毒性LD50雌性为35.9mg/kg，雄性为38.3mg/kg，对大鼠的急性经皮毒性LD50雌性为316.0mg/kg，雄性为464.0mg/kg。

研究者通过对AVMs中毒致死的动物进行研究，发现在其脑组织中均可检测到高含量的药物。有研究者认为，大脑药物含量过高可能与这些物种缺乏P-糖蛋白有关。P-糖蛋白是一种跨膜蛋白，可以将某些药物运进或运出细胞，从而减少药物的组织分布和生物利用度，并促进药物消除。而且它还限制药物进入机体潜在的敏感区域，如中枢神经系统。因此P-糖蛋白活性低的动物在口服药物后生物利用度更高，而且其中枢神经组织会蓄积更多药物。

3危害

一般认为，使用AVMs后，宿主动物所产生的副作用与寄生虫的死亡有关。牛皮蝇第一期幼虫迁移并寄生于牛的椎管和食管，在这些部位死亡的寄生虫可能会导致出血而引起动物轻瘫，或引起食管肿胀发炎，但这种副作用的发生概率极低。马属动物出现的腹部皮下肿胀可能与寄生的颈盘尾丝虫有关。犬体内如果寄生了犬恶丝虫，则用药后可能出现呕吐、流涎、腹泻、抑郁甚至死亡。

AVMs的潜在毒性使得其在用于人医治疗时受到极大的关注。然而，调查世界范围内以IVM治疗人盘尾丝虫感染的病例，结果表明仅有很少的人会出现搔痒、水肿、出疹、头痛、肌肉痛等副作用，这可能是由于死亡的丝虫而引起的过敏反应。

4国内外限量要求

目前，AVMs在动物性产品中的MRL已有规定，但各国家和组织的限量标准并不相同（表5-36）。

5样品前处理方法

5.1单一药物的提取和净化

织农作物和动物饲料等。其样品前处理方法一般是通过有机溶剂提取，而后通过LLE、SPE或免疫亲和色谱（IAC）来进行样品净化。此外，也可以应用MSPD或超临界流体萃取（SFE）来进行药物提取。有些方法还会进行柱前衍生化，样品提取液在衍生化后可能还需要再次净化处理。多数方法只进行简单的提取，一步SPE净化后检测。不过，也有 道采用多种不同溶剂液-液分配或不同SPE小柱联用的净化方法。

5.1.1血液和血浆

早期的测定血浆中AVMs的方法通常基于LLE、LLP和吸附色谱等不同方法的联用来达到净化的目的。

Tolan等用乙醇-水来提取血浆中AVM和IVM，然后再用乙酸乙酯来萃取。提取液在衍生化前后分别用弗罗里硅土（Florisil）柱和硅胶柱净化。Schnitzerling等先用乙醇从血液中提取IVM，而后再用丙酮进行萃取。先将血液置于4℃下使蛋白质沉淀，之后加入乙醇-水，用正己烷萃取，再用乙腈从正己烷中提取，将乙腈吹干，以四氢呋喃复溶后进行LC-UV检测。

近年来已发表的许多方法均基于键合硅胶SPE柱来净化。Chiou等用甲醇从血浆和牛奶中提取IVM，用C2柱净化提取液。提取物衍生化后，再进一步用二醇基柱（diol SPE）净化后检测。Nowakowski等后来对这一方法进行改进以用于血浆样品中DOR的检测。Oehler等发现C18柱从血清中分离IVM比C2柱更有效。Dickinson等用乙腈从血清和肌肉组织中提取IVM，再用C18柱净化。De Montigny等采用乙腈-水提取血浆中的IVM，然后以C18柱净化提取物。Alvinerie等将此方法改进后用于山羊血浆和奶中IVM的测定。Chen等以HLB（Oasis）SPE柱净化人血浆中的MOX以进行检测。用乙腈-水从血浆中提取MOX，提取液加入SPE柱，水和甲醇-水淋洗，异丙醇洗脱。

对血浆中AVMs的检测主要用于药物残留消除研究。由于此项研究需要采集大量样品，其相关研究人员更趋向于使用自动化和小型化的净化方式。Lanusse等将Alvinerie等早期建立的方法实现了自动化，并将其应用于牛血浆中MOX、DOR和IVM残留的测定，随后又进行了血浆中EPR的测定。在药物分离方面，Antonian等也开发了一种自动净化血浆中EPR的方法。Harison等开发了一种基于96孔板的自动提取和净化方法来测定血浆中的DOR。血浆样品用乙腈-水提取，然后转移到一个96孔C18SPE板，置于真空装置下。吸附填料用水洗净，真空抽干后，用甲醇洗脱至96孔板。将洗脱液蒸干，衍生化。96孔板密封后置于液相色谱自动进样系统中检测。Mitsui等发现用磷酸盐缓冲液-BSA简单稀释血清样品便可用于免疫检测。

5.1.2动物组织

对于动物组织中残留检测，提取之前必须将组织样品切碎或匀浆。在样品匀浆的同时可加入提取溶液进行提取。已有研究 道了AVMs在肌肉、肝脏、肾脏和脂肪中的提取和净化方法，由于目前只规定了肝脏和脂肪组织中AVMs的MRL，因此多数方法针对这两种组织。

由于复杂的基质干扰，提取和净化肝组织中残留的AVMs一直被视为工作的难点。鲑肉中富含油脂，而AVMs又属于亲脂性药物，因此与其他动物肌肉组织相比，鲑肌肉中AVMs的残留量往往更高。Tway等用丙酮-水提取肌肉、肝、肾和脂肪中的IVM残留，然后再用异辛烷萃取。在检测之前，提取液必须通过沉淀或萃取等方法进一步净化。Prabhu和Reising等也应用类似方法检测IVM在组织中的残留。Khunachak等建立了肝脏、肌肉、脂肪和肾脏中MOX的提取方法，先用乙腈提取，然后用正己烷萃取。Stout等用同样的方法测定了脂肪中残留的MOX。

MSPD也被用于分离组织中残留的AVMs。其步骤为先将样品充分切碎，然后与C18填料混合均匀，再用溶剂萃取。Iosifidou等 道了以MSPD提取鲑肌肉中IVM的测定方法。将鲑肌肉与C18填料混合后装柱。以正己烷淋洗，二氯甲烷/乙酸乙酯洗脱。Alvinerie等将此方法改进并用于测定牛肝中的MOX残留。

SPE是目前应用最广泛的净化方式之一。Norlander等建立了一种生物基质中AVMs的残留检测方法。以乙腈提取猪组织中的IVM，接着用C8柱净化提取液。此方法应用广泛，有两个研究小组基于此方法测定了鲑组织中IVM的残留。Dusi等改进了上述方法，以C18柱替代C8柱获得了更好的净化效果。

Salisbury等用乙腈提取肌肉和肝脏中残留的IVM，提取液先后经氧化铝和C18柱净化后测定。其他研究人员又以类似的方法测定了肝脏和脂肪中的IVM残留。Abjean等先以C18柱净化提取液，衍生化后再用重新活化的同一根C18柱进一步净化，以除去影响TLC测定的衍生化试剂。

近年来，随着具有特殊功能的AVMs药物如EPR等陆续被开发出来，人们针对新药的特性应用离子交换SPE柱来实现净化。Payne等用丙酮-二氯甲烷从牛组织中提取EPR，再用氨基柱（aminopropyl SPE）净化后上机检测。Ballard等采用同样的前处理方法进行了LC-MS/MS确证检测。Kim-Kang等先用乙酸乙酯提取甲氨基阿维菌素，再以阳离子交换柱净化。

5.1.3奶和奶制品

检测牛奶中AVMs残留的方法少有 道。Alvinerie等建立了测定牛奶中IVM残留的LC-MS方法，其前处理是基于Tway等建立的LLP方法。

Kijak等先将牛奶与氨水和乙醇混合，再用乙酸乙酯-异辛烷萃取IVM。首先将提取液蒸干，然后用正己烷复溶，最后再乙腈萃取IVM。

Cerkvenik等建立了一系列乳制品中IVM的测定方法，其前处理程序是基于Norlander等开发的方法。Heller等用乙腈提取牛奶（和肝脏）中残留的IVM，并通过碱性氧化铝柱净化。Dusi等通过乙腈提取EPR，用C18柱净化后进行LC检测。Pollmeier等用乙腈从牛奶中提取EPR后，不经净化直接检测。

5.2多残留的提取和净化

多残留分析是兽药残留监测的趋势。近年来，能够检测两种或两种以上的AVMs的多残留检测方法成为研究的热点。

5.2.1动物组织

Roudaut建立的方法可同时提取ABM、DOR、IVM和MOX，提取后用C18柱净化，用于分离鳟和鲑中的AVMs。该方法仅需称取1g组织，选取1mL的C18柱，以少量的乙腈-水洗脱即可。洗脱液蒸干，衍生化后通过LC荧光方法测定。Ishii等从肝和脂肪组织中提取MOX、ABM、DOR和IVM，通过简单LLP程序来净化。样品先与硫酸钠混合后以乙腈提取，正己烷除脂，LC-荧光检测。Danaher等建立了基于氧化铝SPE柱的净化方法来测定肝脏样品中的MOX、IVM、ABM、DOR残留。

Rupp等使用乙腈提取鲑组织中的IVM和DOR，C8柱和硅胶柱净化，硅胶柱可有效消除残余的组织色素。Van De Riet等用乙腈提取、C18柱净化来测定鲑组织中的依马菌素和IVM残留。Turnipseed等采用Rupp和Salisbury建立的样品前处理方法来提取、净化肝组织和鲑中的AVMs，建立肝脏和鲑肌肉中EPR、MOX、DOR和IVM的多残留LC-MS检测方法。

Howells等在应用Norlander建立的方法提取肝组织中残留的EPR、MOX、ABM、DOR和IVM基础上，开发了基于ProspektTM的在线净化技术，实现了样品的LC-MS高通量检测。用乙腈-水-三乙胺（30∶69.9∶0.1，V/V）提取样品后，将提取液注入HySphere C8柱，然后直接洗脱进行LC-MS分析。

Ali等用乙腈从肝组织中提取EPR、MOX、ABM、DOR和IVM以氧化铝和C18柱净化，并建立了另一种方法净化样品后进行LC-MS确证检测。肝组织提取液加入C8柱，以水-乙腈-三乙胺和正己烷淋洗，然后用二氯甲烷洗脱到另一个碱性氧化铝柱中，再先后用丙酮和甲醇对氧化铝柱进行洗脱。

Danaher等以Ali等建立的氧化铝-C18柱净化程序来分离肝组织中的AVMs，建立了荧光衍生化检测方法。随后，Danaher等又建立了一种SFE方法来提取动物肝脏中残留的EPR、MOX、ABM、DOR和IVM。将肝脏样品与Hydromatrix吸附剂混合后装入一个含有2g氧化铝的容器中。在100℃温度下，以超临界二氧化碳（SF-CO2）对样品进行提取，压力30 MPa，流速5.0L/min。药物被在线吸附于碱性氧化铝上，随后再以4mL甲醇-乙酸乙酯（70∶30，V/V）洗脱。通过与离线检测相比较发现，在线检测可降低MOX色谱峰附近的基质干扰。该方法提高了净化和提取的效果，无须进一步净化便可测定。

Coles等采用乙腈提取和C18柱净化的方法对肝脏和鲑肌肉中残留的EMA、DOR和IVM进行LC-MS/MS检测。Daeseleire等也以同样的方法检测了肉类样品中EPR、MOX、ABM、DOR和IVM的残留。他们还将肉类样品用蛋白酶在60℃消化2h后，再用二乙基乙醚来提取药物，进行LC-MS/MS检测。用SEL作为内标，以提高检测的准确度和精密度。

Knold等用乙腈从猪肝中提取IVM和DOR，以ABM为内标建立了检测方法。将样品在21 000g离心，取上清液检测。药物色谱出峰较晚，但在目标峰附近没有观察到干扰峰。Rudik等建立了一种检测血清和肝中的EPR、MOX、DOR、IVM和SEL的简单方法。样品用乙腈提取，并加入氯化钠除去乙腈中的水，将乙腈层过滤后进行LC-MS检测。Nagata等建立了可同时提取和净化牛肝脏和肌肉中6种AVMs [EPR、MOX、米尔贝霉素（milbemycin）A3和A4、ABM、DOR和IVM]的方法。将已均质的组织样品中加入无水硫酸钠和乙腈后匀浆，提取液用正己烷除脂，氨基柱净化后检测。

5.2.2奶和奶制品

Roybal等将C18柱和碳柱联用来净化牛奶中残留的EPR、MOX、DOR和IVM。Turnipseed等基于上述样品前处理方法，建立了牛奶中AVMs的LC-MS多残留检测方法。Daeseleire等用乙腈提取、C18柱净化建立了牛奶中6种AVMs残留的LC-MS/MS检测方法。

Schenck等以LLE原理进行样品提取，建立了牛奶中MOX、ABM、DOR和IVM的多残留检测方法。Dusi等采用乙腈提取、C18柱净化的方法来检测牛奶中的EPR、MOX、ABM、DOR和IVM残留。将净化后的提取物衍生化，硅胶柱净化后测定。Capurro等基于Nordlander等建立的提取和净化方法，建立了牛奶和奶制品（奶酪、黄油和脱脂奶粉）中6种AVMs残留检测的前处理方法。对于脂肪含量高的样品，可在样品中加水，加热到80℃并进行搅拌。

5.3免疫亲和色谱（IAC）

IAC是以免疫结合反应为基础的柱色谱技术。其原理是将抗体与惰性基质偶联制成免疫吸附剂，装柱。当待测组分流经IAC柱时，抗原与相应抗体选择性结合，其余杂质则流出IAC柱。再利用适宜的洗脱剂将待测组分洗脱，使样品得到有效分离、净化和浓缩。其操作方式有分批法和柱色谱法两种，并且IAC柱再生处理后可重复使用。多组分免疫亲和色谱（Multi-immunoaffinity chromatography，MIAC）和高效亲和色谱（HPIAC）是其发展方向。MIAC是指含多种抗体或群特异性抗体的IAC柱，它能同时对多种组分进行分离、净化，具备了处理多残留组分的能力。HPIAC多采用键合相硅胶或控制孔径的玻璃珠，是IAC的选择性和HPLC高效分离的完美结合。IAC已被广泛应用于兽药残留分析、农药残留分析、环境污染物分析等。最初的研究是在使用IAC柱对样品进行净化之前，要先用C18柱净化。而后来研究人员发现过C18柱的净化步骤是不必要的，因为直接用IAC净化后进行LC-UV测定，其结果并没有明显的干扰。后续研究表明用IAC柱分离肝脏中的IVM有助于去除基质干扰。此外，IAC柱净化需要大量溶剂淋洗以获得干净的色谱图。

Li等利用IAC建立了绵羊血清和猪肝脏中IVM残留的检测方法，检测限分别是1ng/mL和2ng/g。Wu等建立了IAC-LC-MS检测方法，检测猪肝脏中的IVM和AVM残留，检测限可达5ng/g。He等又开发出一种基于IAC柱的多残留净化方法分离牛肝中的ABM、DOR、IVM和EPR，其回收率为79%～116%。

综上所述，样品前处理方法的选用一般取决于样品基质和待测药物的数量。目前适用于AVMs多残留检测的样品提取和净化方法已有 道（表5-37）。其中，乙腈提取、C8柱净化是最适用于牛奶中AVMs的前处理方法。然而，对于肝组织的净化，则需要将氧化铝和C18柱联用才能达到检测要求。发展选择性更好的、可与LC-MS/MS联用的在线痕量富集系统是最有效的前处理方法。良好的样品净化方法可降低质谱测定中的离子抑制效应，从而获得更加稳定的检测信号，并改善检测信噪比。

6免疫分析

免疫分析的基本原理是抗原抗体的特异性反应，其为近年来快速发展的一种残留检测方法，具有灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便、快捷、成本低廉等优点。而免疫分析的核心试剂是抗体，AVMs的相对分子质量均小于5000，是半抗原，不能刺激动物机体产生免疫应答，需与大分子物质如牛血清白蛋白（BSA）等偶联后才能刺激动物产生抗体。

6.1抗原的合成

6.1.1半抗原的结构改造

小分子半抗原的结构改造是抗体制备的关键和难点。目前，对AVMs的结构改造方法主要分为两大类。

（1）对C4”-OH部位的结构改造

一般认为对C4”-OH部位进行人工改造才能制造具有免疫活性的抗原；而选择C5-OH，突出的是AVMs的双糖部分，是非免疫活性部位。通过计算机模拟AVMs的优势构象，推测AVMs的免疫活性部位为大环内酯和双螺酮缩醇部分（非糖部分）。构效关系研究表明:大环内酯部分为AVMs的药效基团，结构改造一般集中在侧链。所以认为在C4”-OH部位构建间隔臂所获得的抗体可能识别多种AVMs。

常见的对于C4”-OH结构的改造主要分三步进行，首先用叔丁基二甲基氯硅烷将AVMs的C5-OH保护；然后在4-二甲基氨基吡啶催化下，用琥珀酸酐将AVMs的C4”-OH进行琥珀酰化；最后再用对甲苯磺酸保护基团，从而得到半抗原4”-O-（单）琥珀酰AVM（4”-O-succinoylAVM）。Schmidt等成功制备了4”-O-succinoylIVM半抗原，将此半抗原以活性酯法分别与BSA、伴清蛋白（Con）及钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联制成了三种免疫原，并制备了单克隆抗体。其IC50达到了3ng/g，且对ABM具有交叉反应。此后李俊锁等、何继红等以类似方法分别制备了AVM、DOR的免疫原及相应的抗体，且这些抗体均对一种或多种AVMs有交叉反应。以上述方法合成的多种AVMs抗原均具有显著的免疫原性，但其半抗原4”-O-succinoylAVM的制备方法极为繁琐，需要进行C5-OH保护、C4″-OH琥珀酰化、脱保护基三步反应，且每步反应均需对产物进行纯化和鉴定。

Mika Kondo 道了一种新的C4″结构改造方法，将依马菌素（emamectin）的C4”-NHCH3与琥珀酸直接反应，成功在其4”位引入一个含羧基的丙酰基间隔臂。该方法只需一步反应和纯化即可，大大提高了半抗原改造的产率和成功率。以此半抗原制备的抗体的IC50为2.6ng/mL，与AVM B1的交叉反应率为78%。

（2）对C5-OH部位的结构改造

Schmidt的研究表明，选择C5-OH构建琥珀酰间隔臂所获得的免疫原并不具有免疫原性，可作为一种包被原。Yoshinori等将IVM的C5-OH用硝基苯基修饰（nitrophenyl）构建了一个新的间隔臂，从而合成了半抗原5-O-[（4-nitrophenyl）oxylcarbonyl]IVM，其可与BSA偶联作为免疫原。以此免疫原制备的多克隆抗体效价在1×104以上，建立的生物素-亲和素直接竞争ELISA方法来检测动物血清中的IVM残留，检测限可达0.1ng/mL。此外，为了避免针对间隔臂的抗体对试验的干扰，Schmidt又构建了一种新的间隔臂4-氯甲酰基丁酸甲酯（carbomethoxyloxime）来制备包被原。

以往研究所用的载体蛋白多为BSA、KLH等，而Crooks等以转铁蛋白（apo-transferrin）为载体合成的5-O-succinoylAVM-apo免疫原成功免疫获得了抗AVM的特异性抗体。此抗体的IC50为4.4ng/g，且与DOR有13.5%的交叉反应。后来Crooks等用同样的免疫原制备了针对IVM的单克隆抗体，此单克隆抗体对除IVM外的多种AVMs均具有一定的交叉反应，如EPR（92%）、AVM（82%）、DOR（16%）。Samsonova等又以Crooks的方法制备了抗IVM的单克隆抗体，其对AVMB1（abamectin，ABM）、EPR、依马菌素和DOR的交叉反应率分别为178%、112%、70%、20%（免疫传感器测定），其中ABM、DOR与其他药物的数据相差很大，Samsonova认为DOR的交叉反应率低可能与其分子上C25位特殊的环己基有关。张梅等以多聚赖氨酸（PLL）为载体合成的5-O-succinoylIVM-PLL免疫原也成功获得了IVM的特异性抗体。而且其研究结果显示在比较了C5-OH和C4”-OH分别作为半抗原反应位点时，偶联同一载体PLL制备抗原的免疫原性，前者要高于后者。

上述方法，虽然仍以BSA为载体，但通过改变间隔臂成功制备了具有免疫原性的抗原；而Crooks和张梅等通过改变载体蛋白而不改变间隔臂种类，也获得了同样的效果。由此证明，间隔臂和载体蛋白是制备AVMs免疫原的重要因素。

另外，目前所制备的这些抗AVMs的抗体与美贝霉素类，如米尔贝霉素肟（milbemycinoxime，MILO）和莫西霉素（MOX）等与AVMs结构类似的另一类大环内酯类抗寄生虫药物均无交叉反应。而且，刘媛等以5-O-succinoyl-MILO-BSA（MILO肟羟基与琥珀酸酐反应）制备的多克隆抗体对AVM和IVM也均无交叉反应。因此可推测AVMs分子C13位上的双糖基结构对抗体的识别也有着重要作用。

6.1.2完全抗原的制备

含有羧基半抗原与载体蛋白的偶联方法有混合酸酐法、碳化二亚胺（EDC）法和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）法。其中NHS法利用NHS和半抗原生成酯，在EDC的作用下，产物与蛋白质失水生成稳定的连接。该方法偶联的效果较好，对载体蛋白的变性作用最小，所以已发表的文献中大多采用该方法制备免疫抗原。

Eilanger认为半抗原与载体蛋白的结合比在（5～25）∶1范围内可取得较好的免疫效果，过高、过低均会影响免疫效果。本部分所提到的半抗原与载体蛋白的结合比绝大部分都处于这个范围内。

6.2抗体的制备

Schmidt等将4”-O-succinoylIVM与BSA、CON、KLH分别偶联的三种免疫原混合后免疫小鼠，制备了抗IVM的单克隆抗体，并重点研究了五株灵敏度最高的抗体。五株抗体均属于免疫球蛋白IgG1κ亚类，均可以同时识别IVM和AVM（未提供交叉反应的数据），标准曲线的IC50分别为3ng/g和7ng/g。但每种抗体对IVM和AVM的IC50值均有明显差异，表明每种抗体的识别位点各不相同。

Yoshinori等通过化学反应在C5-OH上连接苯环制备的免疫原，成功免疫得到了针对IVM的高特异性多克隆抗体。以间接ELISA监测兔血清抗体滴度的变化显示，首免后从第6周到第12周的抗体滴度均高于1 000，第8周后加强免疫也不能显著增加抗体滴度。

李俊锁等以４”-O-succinoylAVM-BSA 为免疫原,五免后动物血清的琼脂扩散效价均在１∶32以上,隔3周后做加强免疫，制备了抗AVM的多克隆抗体。此多克隆抗体对AVM有很高的亲和性（IC50＝5.6ng/mL），与IVM的交叉反应率为56%。

Crooks等以5-O-succinoylIVM与转铁蛋白的偶联产物作为半抗原，制备了抗IVM的多克隆抗体。此多克隆抗体仅与DOR有一定交叉反应（13.5%）。Crooks等在以往的基础上制备了针对IVM的单克隆抗体，此单克隆抗体对除IVM外的多种AVMs均具有一定的交叉反应，如EPR（92%）、AVM（82%）、DOR（16%）。Samsonova等用Crooks的方法也制备了抗IVM的单克隆抗体。

6.3免疫学检测方法的建立

免疫学检测方法是一种以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析手段，具有高度的选择性和灵敏度，可使分析过程简化，适合复杂基质中痕量组分的分析。目前文献 道的AVMs免疫分析法主要包括ELISA、荧光免疫测定法、免疫传感器等。

Yoshinori等建立了间接竞争ELISA方法来检测动物血清中的IVM残留，将血清100倍稀释后直接进行ELISA分析，检测限为10ng/mL；为提高监测的灵敏度，又以生物素标记IVM（IVM-biotin）、亲和素标记过氧化物酶（avidinperoxidase）建立了生物素-亲和素ELISA（ABC-ELISA）来检测动物血清中的IVM残留。此方法的回收率为980%～1024%，变异系数小于18.1%，检测限可达到0.1ng/mL。

李俊锁建立了检测牛组织（血浆、肌肉和肝）中AVM残留的间接竞争ELISA方法。探讨了反应条件和样品前处理方法，并对添加样品进行了测定。此竞争反应可耐受20%（V/V）的甲醇。使用４″-O-succinoylAVM-OVA和5-O-succinoylAVM-OVA做包被原，AVM标准液的IC50为1.8～4.0ng/mL，检测限可达0.02～0.2ng/mL。其前处理方法为：5g样品以10mL甲醇超声波振荡提取30min，－20℃冷冻2～3h，取出后立即以2 000r/min离心5min，取上清液适量与等体积的PBST混合，直接进行ELISA检测。各样品介质中AVM的IC50为3.6～30.2ng/mL，样品检测限为0.1～0.6μg/kg。在60～600μg/kg添加浓度范围内，回收率为87.9%～108.8%，变异系数为2.8%～16.9%。此方法较为简便，结果亦很理想，适宜对大批量样品进行快速检测。

Crooks等 道了利用IVM多克隆抗体检测牛肝脏中IVM残留的ELISA检测方法。但是样品提取方法极其复杂，即4g样品加入8mL乙腈提取，离心后，加入氯化钠溶液和正己烷；乙腈层吹干后，2mL去离子水复溶，并经过NH2SPE柱净化，20mL乙酸乙酯洗脱，再用氮气吹干，0.5mL乙醇复溶，进一步浓缩至0.06mL时，加入0.14mL的0.001mol/L的醋酸钠溶液，混合后，进行ELISA分析。该方法的检测结果令人满意（回收率大于89%），但是样品处理过程过于繁琐，不利于实际样品的快速筛选工作。

Crooks等以IVM单克隆抗体建立了IVM的解离增强镧系元素荧光免疫分析（DELFIA），并检测了牛奶中的IVM残留。DELFIA是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成Eu标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂使Eu3＋从复合物上解离下来，自由Eu3＋同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，该分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。Crooks将抗体包被后，以Eu标记的人血清白蛋白（IVM-HAS）偶联物作为竞争物，来进行IVM的直接竞争荧光免疫测定。在25ng/mL添加浓度下，其日内和日间变异系数分别为11.6%和15.8%，方法检测限是4.6ng/mL。前处理方法为:乙腈提取奶样中的药物，正己烷除脂；减压蒸干乙腈层，残留物以乙酸乙酯复溶，并经过NH2柱净化后检测。

Samsonova等用抗IVM单克隆抗体研制了以表面等离子共振技术（surface plasmon resonance technology，SPR）为基础的免疫传感器来检测牛肝脏中的IVM残留，检测限是19.1ng/g。前处理方法为:乙腈提取，剧烈振荡10s；在10℃条件下3 000g离心10min；取上清液，加入蒸馏水和三乙醇胺，小心涡动混匀后用C8柱净化、乙腈洗脱，60℃下氮气吹干溶剂，乙醇复溶，混匀后检测。Shi等研究 道了牛肝组织中AVM、IVM、EPR的多残留检测间接竞争ELISA。筛选具有对AVMs最高抗体滴度的血清进行间接竞争ELISA反应，此血清与AVM、EPR和IVM的交叉反应率分别为100%、145.4%和25%。此方法的定量限为1.06ng/mL。

总之，免疫分析法的灵敏度较高、特异性强，可满足目前兽药残留检测的需要；而且由于其选择性高，对样品前处理要求简单，适用于大量样品的快速筛选。但免疫分析法提供的待测物组成或结构方面的信息太少，结果易出现假阳性，无法作为一种确证方法；而且免疫分析法的稳定性易受多方面因素影响。不过，随着免疫分析技术的进步，特别是以重组抗体为代表的抗体制备技术的发展，免疫分析法将在动物源性食品兽药残留快速检测领域发挥越来越重要的作用。

7仪器分析

7.1液相色谱（LC）检测

已有研究发现使用90%或更高比例的有机溶剂作为流动相可以很容易地在C18色谱柱上分析4种AVMs药物（MOX、ABM、DOR和IVM）。流动相中的有机溶剂可以是甲醇、乙腈或两者的混合物。Schenck和Lagman以乙腈-四氢呋喃-水作为流动相，分离这4种AVMs药物，达到了更好的色谱分离效果，峰高提高了2倍多。De Montigny等以类似的流动相组成，通过C8填料色谱柱检测了血浆中的IVM。水在流动相中所占的比例取决于待检药物的数量和所选检测系统。选用荧光检测时，会将这些药物衍生化为极性更小的分子。因此可能要提高流动相中的有机溶剂含量，达到与非衍生化药物差不多的出峰时间。

色谱分离一般选用标准的LC柱，长150～250mm，直径为3.0～4.6mm，填料粒径为3.0～5.0μm。一般情况下，选用有机溶剂-水的混合流动相便可对大多数AVMs实现良好的色谱分离，无须在流动相中添加缓冲液。然而，Alvinerie等以醋酸-甲醇-乙腈为流动相测定了山羊血浆中的IVM。加入醋酸的目的是为MS检测提供足够的电离。Heller等发现用较窄的色谱柱（150mm×2mm）进行MS检测时必须在流动相中加入乙酸铵缓冲液。Chiou等建立了一种快速的梯度洗脱方法来测定牛奶和血浆中的IVM，使用短色谱柱（50mm×4.6mm）仅需要很短的平衡时间。Stout等使用短色谱柱建立了MOX残留的LC-MS检测方法，流动相为含有醋酸胺的梯度洗脱。Cobin等在流动相中加入三乙胺改善色谱分离。Valenzuela等发现必须在流动相中加入甲醇来满足MS检测时电离的需要。

Payne等发现用C8色谱柱并在流动相中加入三乙胺和磷酸可使EPR检测达到最好的色谱分离。后来其他人发现，用C18色谱柱，并提高流动相中有机溶剂含量也可达到EPR的检测要求。Sutra等发现加入离子对试剂，并使用未活化的碱性C18柱也可获得合适的色谱分离。有 道表明，流动相中加入磷酸对EMA的色谱分离也是有必要的。此外，虽然基质干扰对AVMs紫外检测的影响很大，但选择适当的色谱柱和适宜的流动相成分可以克服这一干扰，或者通过优化净化方法、衍生化后荧光检测或MS检测来加以克服。

使用等度流动相便可以分离6种AVMs药物。梯度洗脱可用于一般的色谱分离或是消除上次进样残余物对随后测定的影响。在LC-MS检测中，梯度洗脱应用得相当频繁，因为延迟洗脱可能会干扰MS的电离过程。因此当分析物尚未从色谱柱上洗脱时，LC的液流并不注入MS检测。而荧光检测一般使用的是等度流动相。Knold等建立了肝组织中IVM、DOR和ABM的LC测定方法，就是通过梯度洗脱除去色谱柱中的干扰。Farer等建立了EMA的LC-UV检测方法，采用梯度洗脱方法分离饲料基质中干扰峰。

Roudaut等使用基于乙腈-水梯度流动相在20min内实现了5种AVMs药物的色谱分离，在MOX的色谱峰附近可观察到一个基质干扰峰。Danaher等在肝脏提取样品中观察到了同样的干扰色谱峰，通过梯度洗脱使其与待测分析物峰相分离。对于AVMs的LC检测，为获得更好的分离效果和峰形，建议采用梯度洗脱方法。

7.1.1紫外检测法

由于AVMs药物结构中具有强紫外吸收基团，因此紫外检测被认为是一种非常稳定而有效的检测方法。然而当检测这些药物在血浆、组织和牛奶中的低水平残留时，紫外检测可能无法达到要求。Schnitzerling等检测牛血液和血浆中的IVM，在254nm波长下，血液中检测限为5μg/kg。

Oehler等使用波长245nm对牛血清中的IVM检测时，检测限为2μg/kg。Reuvers等建立了组织肝脏中IVM在254nm波长下的紫外检测方法，可区分出IVM峰和基质干扰峰。该方法的检出限为5～10g/kg。

7.1.2荧光衍生化检测法

与紫外检测法相比，柱前衍生化-荧光检测法具有更强的灵敏度和选择性。因此在检测低水平的AVMS残留时，常选用荧光检测。

其荧光衍生化原理和方法如表5-38和图5-55所示。早期通常用更多的反应试剂来缩短反应时间，降低反应温度，而且无须在衍生化后进一步净化。

许多AVMs衍生化产物都不太稳定，特别是EPR的衍生化产物在短期内可迅速降解，ABM、DOR和IVM等的衍生化产物也都不稳定。因此样品或标准品的衍生化产物不能够长期储存，必须在24h内检测完毕。为克服这一弊端，研究者开发出了更稳定的荧光衍生化方法。

Tolan等最先开发出一种荧光衍生化方法来测定血浆中的ABM和IVM。将药物与乙酸酐在吡啶中反应，药物分子失掉2个水分子并使４″位的羟基乙酰化。经脱水后与药物本身形成共轭二烯结构，导致荧光的产生。在105～110℃反应22～24h可得到最佳效果。由此方法产生的荧光衍生物（包括标准品及样本）需要在测定前经硅胶净化。在激发波长364nm、发射波长480nm时的检测限为0.5μg/kg。

Tway等对上述方法进行改进，通过用更强的亲核催化剂N-MIM和DMF来代替吡啶，反应时间大幅减少（仅需90℃反应60min）。检测前用硅胶SPE柱进行净化。该方法被已广泛用于AVMs在动物肝脏、鲑肌肉、牛奶和奶酪中的残留检测。

De Montigny等在Tway等方法的基础上通过引入更强的酰化剂三氟乙酸酐（TFAA）来代替乙酸酐，并用惰性的乙腈做溶剂，反应时间小于30s。对血浆样品的检测限可达10～20pg/mL。需要注意的是，此方法所产生的AVM、DOR和IVM荧光衍物与Tway等的方法不同。这是因为在药物分子的４′-位形成的是三氟乙酰酯，而不是乙酰酯。然而，对于EPR和MOX，其所产生的衍生产物是相同的。该反应几乎是瞬间完成的，仅需要常温反应，且几乎没有次级产物，无须净化便可检测。此衍生化方法是AVMs分析研究的重大突破。

虽然ABM、DOR和IVE的荧光衍生物不稳定，但过夜不会降解，可过夜检测。不过，应用自动进样器进行在线衍生化后直接检测可以克服这一问题。Payne等建立了EPR的自动衍生化方法。这种方法产生的EPR荧光衍生物是不稳定的，2h可降解50%。方法步骤为样品提取物复溶于MIM-乙腈，转移到LC进样小瓶中并存放于LC系统的自动进样器中。三氟乙酸酐加入LC进样小瓶，自动混匀，反应2～7min后进样。DeMontigny等基于上述自动衍生化建立了牛奶和血浆当中EPR的检测方法，此方法对牛奶和血浆中EPR的检测限分别为80pg/mL和20pg/mL。Wang等建立了牛肝脏中AVMs的HPLC-FLD的多残留检测方法。将肝脏用乙腈提取，吹干后加入100μLMIM-乙腈（1∶1，V/V），然后加入150μLTFAA-乙腈（1∶2，V/V），最后加入750μL甲醇，混匀后转移到进样小瓶中，需在6h内检测。

ABM、DOR、IVE和SEL的三氟乙酰基衍生物（酯式）不稳定，易水解形成更稳定的醇式衍生物。为增加衍生物的稳定性，有研究者对DeMontigny等建立的方法进行了改进。Chamekasem等将ABM在MIM-TFAA-DMF混合物中30℃温育1h，然后将生成的三氟乙酰基衍生物与20mol/L氨化甲醇进一步反应，形成较稳定的醇式衍生物。

类似的改进衍生化方法也被应用到DOR和SEL的残留检测中。Nowakowski等以三乙胺代替MIM，用TFAA作为酰化剂。Walker和Fenner将该衍生化法用于检测DOR和SEL的残留。

Cobin等将衍生化提取物与流动相（甲醇-水-三乙胺）混合后室温反应10min便可得到稳定的醇式ABM荧光衍生物。结果表明，此方法可使ABM及其8，9-Z型异构体均转换为相同的衍生化产物。同样Rupp等研究显示IVM和DOR与乙酸铵在甲醇中反应能产生更加稳定的荧光衍生物。

Roybal等基于光化学反应建立了EPR等几种AVMs的柱后衍生化方法。Ali等研究发现EPR的衍生化反应受温度的影响，并证明在65℃加热90min条件下可产生稳定的衍生物。该方法也可用于MOX、ABM、DOR和IVM的检测，虽然它们的衍生化不受温度影响。Dusi等以Tway等建立的方法检测了牛奶中的EPR残留。

Nagata等同样以Tway等建立的衍生化方法检测了组织中6种AVMs残留。他们发现将提取物用乙腈简单稀释，便可省去衍生化之前的净化步骤。Nagata等应用该方法获得了稳定的EPR衍生物，但样品和标准品均需在衍生化后用硅胶柱净化。

Danaher等利用De Montigny等开发的衍生化方法生成了稳定的EPR荧光衍生化产物。该方法将EPR与酸在高温下反应得到了稳定的EPR衍生物。通过响应曲面法（RSM）来优化反应程序，仅需在EPR中加入50μL乙酸，65℃反应30min即可获得满意的效果。该衍生化方法已成为建立肝组织中 EPR、MOX、ABM、DOR和IVM 的多残留测定方法。

Berendsen等建立了上述5种AVMs在牛奶中的测定方法。先用三乙胺和三氟乙酸加速反应生成酯式衍生物，随后再转换为较稳定的醇式衍生物。其研究表明获得的荧光衍生物可稳定存在80h。

Downing等提出了一种全新的衍生化方法来检测肝组织中IVM残留。肝脏样品提取物先以Tway等建立的方法进行衍生化反应，再在酸性条件下水解生成极性更低的衍生物。结果表明，荧光衍生物可分别在甲醇或丙醇中进一步与硫酸反应，生成单糖或苷元衍生物（图5-56）。Chiu和Liu提出一个类似的水解方案来鉴定脂肪组织中IVM的非极性代谢产物。他们发现，脂肪酸和药物的结合物可以被胆固醇酯酶选择性水解分离，而糖基却能被保留；换用更强的对甲苯磺酸进行水解时，则可导致脂肪酸和糖基同时被解离（图5-57）。

7.1.3质谱检测（MS）

目前，LC已经与许多不同配置的MS联用来进行生物基质中的AVMs的残留检测。有些LC-MS方法纯粹是基于确证的目的，仍选用荧光方法来定量检测。近年来建立的LC-MS方法既是AVMs的确证方法，也是其残留的定量分析方法。多种不同的MS离子源已经被用于AVMs的残留检测，包括粒子束、热喷雾（TS）、