引物篇：普通PCR 和 QPCR 引物异同点

Q问题： 普通PCR 和 QPCR 引物 是否一样？

A 回答： 二者的设计原则有相同也有不同；

相同处：

? 序列的查找是一致的；

? 序列选取应在基因的保守区段；

? 选取合适的扩增片段大小

? 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；

? 避免引物自身形成环状发卡结构；

? Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；

? 引物之间的TM相差避免超过2℃；

? 引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；

不同处：

   Real time PCR 引物

? PCR 产物长度；real-time PCR要求在300bp以内，一般80-150bp 之间；

? 多对目的基因同时扩增，文献上查来的引物条件会不同，需要设计尽可能条件一致的引物；

? 目的基因含量比较低时，需要设计灵敏度比较高的引物；

? 相对电泳法，Real time PCR灵敏度比较高，对引物的要求更高，引物二聚体要少；熔解曲线要求单一产物；

? Real time PCR的目的是进行定量或者相对定量，对扩增的效率有要求；对引物的二级结构要求高；

普通PCR 引物：

? 根据实验的要求不同，长度一般是从150bp到几千bp 不等；

? 对二级结构要求没有real time PCR 高；

? 对扩增效率要求不高；

? 可以选用梯度PCR 仪，选择不同退火温度，对引物退火温度要求不需要一致；

验证时不同：

引物的特异性（相同点）：

?引物的特异性在使用前用blast 来保证；

不同点：real time PCR

?在实验结果中通过熔解曲线来验证；

?PCR的特异性产物峰应与引物 告中的PCR product 相差在两度之内；

普通PCR 通过产物的长度，跑条带，来鉴别产物的特异性；

Real time PCR 可以通过扩增曲线，熔解曲线分析来鉴别产物的相对量，同时也可以对终产物进行电泳分析，更全面，更科学！