准备ELISA实验的正确步骤

ELISA实验的事前准备工作

确定有进行ELISA实验zui重要的仪器：酶标仪

确定实验动物种属和ELISA检测指标:

 *  查找文献，根据临床意义，确定要用的实验动物种属（如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猪、狗等）和用ELISA方法检测的实验指标（如白介素，生长因子，激素等）；

确定要搜集的标本类型:

 * 确定要搜集的标本类型，如血清、抗凝血浆、肺泡灌洗液、脑脊液、尿液、关节华液、组织匀浆、细胞培养上清液等；

确定要收集的标本数量；

确定标本的处理方法；

 * 合理分组，根据实验模型，确定要收集的标本数量；

确定购买试剂盒的厂家和试剂盒类别

 * 根据标本数量，确定要购买的试剂盒的规格和数量；确认适用于要检测的标本的相应规格的ELISA试剂盒的灵敏度、检测范围、价格和到货期等情况；了解试剂盒的整盒有效期和拆开包装後的有效期(各主要成分的开瓶有效期）；
 * 复孔：为了增加结果的可靠性，对标准曲线和标本，要求做双复孔或者三复孔，就是同一份标本，平行做两次或者三次。
如果本身试剂盒的稳定性好，而又不要求每个数据的准确，主要目的是为了统计学意义的话，可以选择做双复孔或者是单孔。

确定时间的合理安排

 * 确定标本的采集时间；根据采集时间来安排标本的保存条件、何时进行试剂盒的购买、如何进行预实验的安排、如何进行大批量标本的检测；
 * 如果标本采集时间过长，如超过六个月，请把标本放在-70度或者液氮罐中保存；在基本上收集完标本的前一个月，进行试剂订购。一般国外试剂的到货期zui长一个月，有足够的时间来等待试剂盒的来到。到货後，取几个样品（zui少两个，估计的低值和高值）和标准品来进行预实验。预实验成功後才能进行大批量标本的实验。

 * 因为每个试剂盒可能都经过长途运输，运输途中可能会导致试剂盒失效，所以预实验是*的，这样才能保证试剂盒没有问题，而且一旦有问题可以快速得到解决，且不用浪费自己辛苦收集的标本。

ELISA实验的事前准备工作二

* 样品合理采集和保存；

具体请参照：ELISA实验标本的采集、处理和保存

* 试剂盒购买；
确认有以下仪器和材料： 

ELISA实验需要但试剂盒中未提供的材料

1. 可在试剂盒要求得波长处进行读数的酶标仪；
2. 水浴箱或者是恒温箱（空气浴）；
3. 能吸取10-200μL的移液器；
4. 可调多道（8）移液器（50－200μL）；
5. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽；
6. 洗瓶或洗板机；
7. 蒸馏水或去离子水；
8. 1升的圆柱形量筒；
9. 移液器：1和（10或25 mL）；
10.移液器枪头；
11.纸巾；
12.计时器，用以监控温育步骤；
13.处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）；

其中需要注意的是：

 * 在实验进行前，需要确认酶标仪在恰当波长能够正常读数，且能正常打印；
 * 用一支温度计来测量使用的温育设备（水浴箱或者是恒温箱），温控是否；因为随着仪器的老化，上面的控温不一定准确，所以需要测量一下实际温度。
 *对移液器，也就是加样器进行校正；确保加样准确。

ELISA实验的进行（预实验）：

* 仔细阅读试剂盒的说明书和注意事项；
 * 参照ELISA和影响ELISA实验效果常见问题原因分析及解决办法，详细明确各个实验步骤。
 * 这一阶段对加样要求不高，主要是熟悉整个操作，验证试剂盒，明确标本是否可以检测出来。
 * 相信做过一次预实验以後，即使是从来没有做过ELISA实验的人，也会信心大增的。
 * 根据预实验反馈的几种结果来确定是进入下一步：大批量实验，还是重新进行预实验。只有预实验结果是好的，成功的时候，才能进入下一步。
 

预实验反馈的几种结果：

 * 预实验结果：定量检测中，如果标准曲线正常，标本值落在zui高点和zui低点之间，则认为预实验结果是好的，成功的。
 * 不好的预实验结果：

1.定量检测中，标准品如果不显色，请查看自己的操作是否有问题；若非操作问题，则有可能是标准品失效，请与厂家，是再做一次，还是返回厂家由厂家来解决；
2.定量检测中，标准品正常显色，但标本没有显色；这时有两种情况：
(1)标本中某些指标含量很低，会出现这种情况；可以通过修改某些操作步骤来达到提高灵敏度；或者通过超滤的方法来浓缩标本，可以使标本能检测出；也可以通过更换更灵敏的试剂盒来达到这个目的。
(2)动物品系问题导致，要检测的指标与试剂盒中包被的抗体不同，可能会导致检测不出。

ELISA实验的进行（大批量标本的实验）

* 与预实验不同的是，正式实验增加了对加样的要求，要求加样迅速、准确。
 * 参考影响ELISA实验效果常见问题原因分析及解决办法之加样。