弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：
① 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出*的使用浓度。
④ 切片上了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
⑤ 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色
① 是否有效地去除了内源性酶和*。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或*丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为： 灭活碱性磷酸酶：zui常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。
饱和处理内源性*：消除内源性*的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性*，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
② 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。zui近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
③ 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
④ 一抗的使用浓度是否过高。
⑤ 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥ DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
1、染色过强
原因 解决办法
抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高，孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因 解决办法
操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5
组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
组织中含内源性* 正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
原因 解决办法
抗体浓度过低，孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期 及时更换试剂
操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）
室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟
4、染色阴性
原因 解决办法
操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照
组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果
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