通过C-18及C-8柱的硅烷基质比较来选择色谱柱

实验部分
配制0.05M的磷酸钾缓冲溶液， 将6.8g的磷酸二氢钾加入1LHPLC级的水中。加入浓磷酸直至pH=3.15-3.2（控制缓冲溶液的pH值在此范围是非常重要的，因为吡啶和N，N-二甲基苯胺对pH值非常敏感），用650ml乙腈和350ml缓冲溶液混合来配制流动相，此混合物经孔径为0.45um的过滤器过滤。为了检测流动相配制是否正确，我们将测试混合物注射入一根色谱柱与此混合物在另一批正在使用的流动相中的保留因子作比较。
制备100ml测试混合物，先将65ml乙腈和4mg*，15mg吡啶，40mg*，15mgN，N-二甲基苯胺，30mg4-正丁烷苯甲酸及400mg甲苯混合，超声波处理一会，然后加入35mlHPLC级的水，再超声波处理直到所有固体溶解（将此测试混合物装入2ml的瓶子，编号为1092，由AlltechAssociates 提供）。同时准备各种物质的标准品，其浓度与在测试混合物中的浓度相同。
流速为1.0ml/min，注射器容量为10ul，柱温为19-22℃，使用紫外吸收检测器，波长为254nm。关于色谱柱的直径，除了Alltech 的alphaBond C-18和Waters的uBondapak C-18柱 （30cm×3.9mm）及Waters的Symmetry C-18和C-8柱 （15cm×3.9mm）之外，所有色谱柱均为15cm×4.6mm。
关于填料颗粒直径，除了Altech 的Adsorbosphere XL ODS（3um）；Waters 的Nova-Pak C-18（4um）；Synchrom 的Synchropak RPP C-18,300（6.5um）和Waters的uBondapak C-18、Alltech的Versapack C-18、Alltech的alphaBond C-18 以及Whatman 的Partisil OPS 和Partidil ODS-2（全是10um）以外，其余所有色谱柱均为5um。颗粒的尺寸仅作为介绍而列出来，如果制造者在制备各种尺寸的颗粒时使用相同的硅基和键合过程，则颗粒的尺寸不影响保留时间、选择性或峰形。
在比较中使用的色谱柱全是新的，不是刚填充填料的就是近来购买的。用多于20倍柱容积的流动相来冲洗所有色谱柱，并且重复地注射测试混合物直到各组分的保留时间变化少于0.02min。
我们注射入标样来确定各组分的出峰顺序并用所获得的简洁的色谱图来计算拖尾因子。我们没有使用柱加热器来控制柱温，但我们确保了实验的环境温度波动少于3℃，环境温度变化引起的保留因子变化少于3%，这样温度的变化在这次比较中可忽略不计。
保留因子用k=（tr-t0）/t0来计算，式中tr是要检测峰的保留时间，t0是*的死时间。计算拖尾因子（T）是使用美国药典的公式T=W0.05/2f，式中W0.05是峰高5%处的峰宽，f是峰高5%处的峰的前沿边缘到垂直的zui大半峰宽。