小鼠高迁移率族蛋白B1（HMGB1）Elisa试剂盒说明书

本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相 关液体样本中高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)水平。用纯化的小 鼠高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加 入高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)，再与 HRP 标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体 复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸 的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)呈正相 关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠高迁移 率族蛋白 B1(HMGB1)浓度。

试剂盒组成：

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

1. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次 离心。

1. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

1. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞 浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分

1

钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

1. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或匀浆器 将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待 检测，其余冷冻备用。

1. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

1. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在*、第二孔中分别加标 准品 100μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液 50μl，混匀；然后从*孔、第二 孔中各取 100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μl， 混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 弃掉，再各取 50μl 分别加到第五、第六孔 中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各 取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl，混 匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准 品稀释液 50μl，混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50μl，

浓度分别为 12μg/L，8μg/L ，4μg/L，2μg/L， 1μg/L）。

1. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μl（样 品zui终稀释度为&

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